邻氨基苯甲酸对达托霉素发酵的影响

2020-03-16

达托霉素(daptomycin1) 是土壤放线菌玫瑰孢链霉菌Streptomyces roseosporus 发酵系列产物A21978C 中的1 种。2003 年美国FDA 批准注射用1 用于治疗由特定革兰阳性菌引起的复杂皮肤及皮肤结构感染。2006 年,1 又被批准用于金黄色葡萄球菌引起的感染性心内膜炎的治疗。如今,1已被誉为万古霉素后新一代耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MARS) 的克星,也成为美国抗菌药历史上收获最大经济效益的品种。

早在1990 年,礼来公司的技术人员就通过添加癸酸的方法( 总添加量3.5 g/L),使1 的产量达到了1 630 mg/L2013 年,杨夏露对1 产生菌进行紫外诱变和原生质体融合处理,最终获得1 产量达到1 388 mg/L 的菌株;吴远杰等通过亚硝基胍诱变和二甲基硫抗性筛选,结合癸酸的添加,使1产量达到1 680 mg/L2015 年,杨一恭通过菌种选育,使1 在摇瓶中的总产量达到6 952 mg/L,发酵罐上通过控制发酵参数,1 的产量达到2 498 mg/L,发酵周期208 h

本实验室在1 发酵工艺的研究中,观察到有1种未知物(2) 浓度与1 浓度在整个发酵过程中存在此消彼长的关系。故本研究旨在确定2 的结构,并探究2 1 产量的影响。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂

AB5600+QTOF 高分辨质谱仪( 美国AB Sciex 公司) 1290 UHPLC1120 HPLC分析仪( 美国Agilent 公司)BMR-B 系列机械搅拌发酵罐( 上海傲中生物工程设备有限公司,25 L) ;超净工作台及恒温摇床( 上海智诚分析仪器有限公司)

邻氨基苯甲酸甲酯( 上海迈瑞尔化学试剂有限公司) 1 标准品购自日本Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.,纯度为typically NLT 98%。

1.2 菌株

玫瑰胞链霉菌Streptomyces roseosporus SIPI-DT-40( 本实验室保存)

1.3 培养基

斜面培养基/g·L-1:酵母浸粉4,麦芽浸粉10,葡萄糖4,琼脂粉15,灭菌前 pH 7.2 7.4121 ℃灭菌20 min

液体种子培养基/g·L-1:胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)30,麦芽糊精35,去离子水配制,pH 6.8 7.0121 ℃灭菌20 min

摇瓶发酵培养基/g·L-1:麦芽糊精90,葡萄糖18,榴花酵母粉17,硫酸亚铁铵0.86,调至pH 6.8121 ℃灭菌20 min

一级种子罐培养基/g·L-1:麦芽糊精25,蔗糖糖蜜10,榴花酵母粉4,黄豆粉12,硫酸亚铁铵0.86,硝酸钾1,泡敌0.3,硅油0.2pH 7.0,计料15 L,消后15 L121 ℃灭菌30 min

二级发酵罐培养基/g·L-1:麦芽糊精25,蔗糖糖蜜10,榴花酵母粉4,黄豆粉12,硫酸亚铁铵0.86,硝酸钾3,硫酸铜0.05,谷氨酸钠0.1,泡敌0.3,硅油0.2pH 7.0,计料7 L,消后7 L121 ℃灭菌30 min

2 方法与结果

2.1 分析方法

样品预处理:取1 不同发酵周期的发酵液1 ml,离心(13 000×g)5 min。取上清液200 μl 加入甲醇800 μl,混匀,离心(13 000×g)5 min。取上清液进行HPLC 检测,将所测得的浓度乘以稀释倍数即为发酵液单位。

发酵单位的测定:HPLC 法。色谱柱 AgilentEclipse Plus C18 (4.6 mm×250 mm5 μm) ;流动相A 3 mmol/L 甲酸铵水溶液( 加磷酸调至pH 2.6)B 乙腈, 线性梯度洗脱( 025 minA 15 55 ) ;流速 1 ml/min ;检测波长 223 nm ;柱温30 ;进样量 10 μl

菌浓的测定:向15 ml 离心管中加入发酵液10 ml,离心(13 000×g)5 min,用10 ml 小量筒量取上清体积v,计算湿菌体体积百分数,即菌浓=[(10-v)/10]×100%。

2.2 培养方法

2.2.1 摇瓶培养方法

取甘油管菌悬液接种至装有斜面培养基60 ml250 ml 茄形瓶中,28 ℃培养6 7 d,取2 cm2大小长满孢子的琼脂块,接入液体种子培养基装量为80 ml 500 ml 锥形瓶中,30 ℃培养40 h。将培养好的种子液3.5 ml 转接至发酵培养基装量为35 ml 250 ml 摇瓶中,240 r/min30 ℃培养6 d

2.2.2 25 L 发酵罐培养方法

取“2.2.1”项下所述的种子液80 ml 转接到25 L一级种子罐中。通气量(VVM)1.0 L·L-1·min-1;搅拌转速0 15 h250 r/min15 24 h300 r/min24 30 h350 r/min30 48 h400 r/min ;罐压 0.05 MPa30 ℃培养48 h 后,转接到二级发酵罐中,接种量为40 ;使用氨水控制pH 6.3 ;发酵8 h 后流加癸酸∶油酸甲酯混合液(1 2)7 g/h78 h 后流加10%麦芽糊精50 g/h30 ℃发酵168 h

2.3 发酵液中未知物2 的研究

在对1 进行25 L 发酵罐发酵培养时,取不同发酵阶段发酵液进行HPLC 检测,可见随着发酵的进行,存在未知物2 1 此消彼长的关系( 1)

由此推测,2 1 的生物合成过程中扮演着重要角色。采用液质联用法对发酵液样品进行分析,推测2 的结构。通过一级质谱分析,该物质相对分子质量为137,结合2 个碎片峰(m/z 138 m/z120) 推测结构为氨基苯甲酸。由此联想到1 的合成前体色氨酸(4) 的合成过程( 2)。在4 合成中的分支酸途径,邻氨基苯甲酸合成酶是其第一个限速酶,而邻氨基苯甲酸则是1 个非常重要的前体。在1 的生物合成中,4 与正癸酰基的缩合是1 合成的起始,也是1 非核糖体肽合成的起始氨基酸。据此推测2 即为邻氨基苯甲酸,但需进一步验证。

2 属于受管制的易制毒品,实验室可通过邻氨基苯甲酸甲酯与氢氧化钠水溶液反应制备得到邻氨基苯甲酸钠( 3)。将制得的3 用发酵液分析方法进行液相检测( 3),出峰时间与2 一致,故可确定2 即为邻氨基苯甲酸。

2.4 摇瓶中3 的添加

照“2.2.1”项下方法,在摇瓶发酵024487296 h 时分别添加3,用量为0.08 g。另设置不添加的对照组。试验结果见图4A。所有添加3 的试验组测得的1 峰面积均较对照组有不同程度的提高。其中,在发酵24 h 时添加3 的促进作用最大,1 峰面积较对照组提高了30.7%。证明摇瓶中3 的添加对1 合成有促进作用,发酵24 h 时添加最佳。

2.5 发酵罐中3 的添加

鉴于摇瓶试验的结果,在25 L 发酵罐上进一步验证添加3 的作用。在发酵罐中,采取流加的模式,从24 h 开始流加,速度为0.08 g·L-1·h-13 总添加量定为8 g,并设置不添加的对照组。结果见图4B,可见添加3 组的发酵单位较对照组提高了23%,在发酵192 h 达到3 432 mg/L。由此确定,3的添加对1 的合成有显著促进作用。

2.6 发酵罐中3 流加速度的考察

鉴于“2.5”项下的结果,考察了3 的流加速度分别为0.050.08 0.1 g·L-1·h-1时对发酵单位和菌浓的影响,结果见图5,可见流加速度为0.08 g·L-1·h-1的试验组中1 产量最高。

3 讨论

本试验中发现了在1 发酵过程中十分重要的前体物2,采用液质联用的方法,确定其为4 的合成前体3。在4 合成的分支酸途径中,分支酸在邻氨基苯甲酸合成酶的作用下生成33 经过一系列的酶促反应生成44 经色氨酸2,3- 双加氧酶及去甲酰化作用得犬尿氨酸,而犬尿氨酸在犬尿氨酸酶的作用下可分解为2,故24 以及犬尿氨酸构成了一个循环。如果在发酵过程中,增加3 的浓度,会使整个代谢流通量增加,促进3 与犬尿氨酸的合成,从而促进1 的合成。所以,无论是在摇瓶中还是发酵罐中添加3 均对1 的合成有显著促进作用,最终将1 发酵单位提高至3 432 mg/L,具有工业化应用价值。

最新评论

暂无评论。

登录后可以发表评论


意见反馈
返回顶部
调查问卷