PARP抑制剂的作用机制和研究进展

2018-03-20

因为紫外辐射、化学毒物等外界因素、细胞自身代谢产物刺激、DNA 复制错误等都会导致DNA 损伤使基因组变得不稳定进而引起癌变。为维持正常生理功能,细胞必须有多种DNA 损伤发现和修复机制,使受损的DNA 得到及时精确的修复。现在很多抗癌药物都是通过损伤肿瘤细胞的DNA 达到杀灭肿瘤的目的。但肿瘤细胞能够激活自身DNA 损伤修复体系进行修复,从而对此类抗癌疗法产生耐性。因此,肿瘤治疗的一个重要途径是阻断DNA修复通路。

Chambon 等发现聚ADP 核糖聚合物( PA) 1 年后,第1 个聚ADP 核糖聚合酶PAP-1 被发现。近几十年来,PAP 在介导DNA 损伤修复和维持基因组稳定等方面的作用成为广大学者的研究热点,因此研发的PAP 抑制剂也是首个靶向DNA 损伤修复机制的抗癌药物。本文就PAP PAP 抑制剂的作用机制、研究情况和结构类型作一阐述。

1 PAP 简介

PAP 是一种聚ADP 核糖聚合酶[poly( ADP) -ribosepolymerase],参与的细胞过程包括染色体重塑、调控细胞凋亡、细胞分裂。PAP 在免疫应答中也发挥作用。PAP 家族有17 种酶,它们的催化区域具有同源性。根据结构域不同分为4种,见图1: DNA 损伤依赖的PAPs,包括: PAP-1PAP-2PAP-3。它们通过DNA 结合域与受损的DNA 结合。② 包含锚蛋白重复结构域的Tankyrases,包括Tankyrase-1Tankyrase-2。③ CCCH PAPs,包括PAP-7PAP-12PAP-13。它们包含与RNA 结合的锌指结构域和有PA 结合活性的WWE( Trp-Trp-Glu) 域。④ 宏观PAPs,仅是单腺苷二磷酸核糖转移酶( mono-ADP-ribosyltransferase)。其中PAP-1 发挥着90% 以上的功能PAP-2 PAP-1 虽然功能类似,但两者在底物的选择上不同。研究表明,PAP-1 基因被敲除的小鼠可以存活,而PAP-1 PAP-2 基因同时敲除的小鼠胚胎致死,这表明2 PAP 对基因组完整性和细胞存活的重要性。

PAP-1 是最典型的PAP 家族成员,由1 014个氨基酸残基组成,包括3 个结构域,见图1: N DNA 结合域( DBD) 、中间自调节域( AD) 、和C 端催化域( CAT) 。其中N DNA 结合域包括3 个锌指基序和DNA 链断裂敏感元件( NLS) ZnⅠ,ZnⅡ识别损伤DNAZnⅢ参与结构域之间的联系,活化蛋白。中间自调节域包括一个BAC1 的羧基端( DNA 修复和细胞信号转导) 并有Capase-3 酶切功能。C 端催化域包括一个富含色氨酸-甘氨酸-精氨酸域( WG) 、α 螺旋结构域( HD) ADP 核糖转移酶结构域( AT)

PAP 未与DNA 结合时,HD 通过自身磷酸化,抑制β-NAD + 结合到PAP AT 结合位点。AT包括供给域( 烟酰胺结合位点) 和接受域( 腺苷结合位点) 。一般PAP-1 的供给域与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( NAD + ) 的烟酰胺-核糖( NI site) 部位结合。所以大部分的PAP 抑制剂模仿烟酰胺结构设计,与NAD + 竞争PAP NI 位点。

2 PAP 介导的DNA 修复途径

认识PAP DNA 修复中的作用为PAP 抑制剂的发展提供了理论基础,见图2PAP-1 通过锌指结构域识别损伤,结合到DNA 缺口处,这一过程使HD 的构象发生变化,失去抑制作用,进而激活PAP-1 的催化活性。PAP-1 催化NAD + 分解为烟酰胺和ADP 核糖,再以ADP 核糖为底物,使受体蛋白包括PAP 自身聚ADP 核糖化( PA ) ,形成PAP-1-ADP 核糖支链。发生PA 化的蛋白因为较大的位阻和带有较多的负电荷使得染色体松弛,降低PAP-1 DNA 的结合力并从DNA 上解离。这使其他的DNA 修复酶如XCC1LIG3POLB 等聚集到DNA 缺口处,进行修复。解离下的PAP-1-ADP核糖多聚物被聚腺苷二磷酸核糖水解酶( PAG) 裂解活化,裂解的ADP 核糖可重新用于烟酰胺合成NAD+PAP 也继续介导DNA 修复。

PAP-1 介导的碱基切除修复( base excision repairBE) DNA 单链损伤( single-strand breaksSSB) 中发挥主要作用。SSB DNA 复制形成复制叉过程中转变为双链损伤( double-strand breaksDSB) DSB 仍可以通过同源重组( homologous recombinationH) 和非同源末端连接( non-homologousend joiningNHEJ) 修复。但后者是一种易错修复机制,最终将会导致细胞死亡。而在H 途径中,PAP-1 通过形成聚ADP 核糖聚合物对ATMME11 等因子进行修饰促进H 修复。

3 PAP 抑制剂的作用机制

3 1 DNA-PAP 的捕获  最初,人们认为PAP-1 抑制剂抑制PAP-1 酶的活性,从而影响SSB 修复。累积的SSB 转化成DSB,在H 缺陷的细胞中,因DSB 无法修复最终导致细胞死亡。但是这并不能解释为什么PAP 抑制剂的效力与H 缺失的细胞死亡无明显相关性。并且PAP-1 抑制剂造成的细胞毒性要远高于敲除PAP-1 造成的细胞毒性。Murai 等提出了一种捕获机制解释其原因,即形成DNA-PAP-1 复合物。PAP 抑制剂能够结合到PAP-1 /2 NAD + 结合口袋,形成构象异构,保持PAP DNA 的结合。由于DNA-PAP 复合物长期存在,使细胞持续在S 期,被捕获的DNA形成遗传毒性更强的DSBH 功能缺陷的细胞最终凋亡。临床的PAP 抑制剂对PAP 捕获能力的差异在设计联合疗法时需要纳入考虑,目前临床RAP 抑制剂捕获DNA 的能力大小为talazoparibniraparib olaparib = rucaparibveliparibTalazoparib的捕获能力约是niraparib 100 倍。这个顺序与它们作为单一药物的细胞毒性相同。Talazoparib可能因拥有较大的结构和立体特异性,导致它对PAP-1 PAP-2 的捕获活性最高。

3 2 合成致死  合成致死是PAP-1 抑制剂作为单药杀伤细胞的直接作用机制。从BAC 基因敲除的小鼠体内到临床,服用olaparib 的遗传性突变的BAC 患者都有明显抑制作用。BCA1 /2 基因在H 途径发挥主要作用。当BAC 基因发生突变,DNA 修复途径将依赖于PAP-1,而PAP 抑制剂使DNA 无法修复最终凋亡,但在正常细胞中有BCA 存在,仍然能够修复DNA,使细胞存活。所以PAP 抑制剂可以作为靶向药物,选择性杀死BCA缺失细胞。除了PAP 抑制剂和BAC 基因突变这一类型,合成致死还发生在Alt-NHEJ( 代替非同源末端连接) 通路抑制和H 缺陷中。H 缺陷的细胞还可以通过易错的Alt-NHEJ 方式修复,Alt-NHEJ通路依赖Pol Q PAP,但当PAP-1 抑制剂阻断Alt-NHEJ 通路,同样会导致细胞无法修复。第3 种合成致死发生在PAP 抑制被激活的NHEJ HR缺陷的细胞中。PAP-1 通过在蛋白上形成聚ADP核糖聚合物修饰Ku70 /80DNA-PKcs 来抑制易错的NHEJ,而PAP 抑制剂能通过抑制PAP 来增强NHEJ 的活性,在H 缺陷的细胞中,导致染色体重排或突变最终使细胞死亡。

3 3 DNA 修复无关的抗癌机制  PAP 参与的各种生物进程,包括染色质重塑、转录调控、缺氧反应、血管生成、上皮细胞向间质细胞的转变和肿瘤转移等。PAP 通过PA 化与转录因子相互作用,可以激活或抑制相关基因转录。如CLOCKHIFNF-κBNFATSmadSp1 Sox2 等。其中HIF 在调节缺氧反应和肿瘤血管生成中起到重要作用。

VEGF 也是最有效的血管生成刺激因子。因此,PAP-1-HIF-VEGF 通路促进肿瘤血管的生成。除此之外,PAP-1 Snail 启动子结合,刺激Snail 和波形蛋白表达,促进肿瘤转移。PAP 抑制剂可以抑制PAP 介导的上述过程,但PAP-1 的功能是否存在基因特异性、细胞型特异性或者细胞状态特异性也值得进一步研究。

4 PAP-1 抑制剂的主要结构类型

目前处于临床研究阶段的代表性抑制剂见表1PAP 抑制剂已经发展到第3 代,以PAP-1 与其抑制剂的复合物单晶结构为基础来进行药物设计。PAP 抑制剂的构效关系表明富有电子的芳香环,有氢键的受体和供体,并且酰胺键N 上至少有1个活泼H 是保证其活性的关键。目前选择性好,活性高的PAP 抑制剂主要有苯并咪唑甲酰胺类、酞嗪酮类和三环吲哚内酰胺类等。

4 1 苯并咪唑甲酰胺类  烟酰胺( 化合物1,见图3) PAP 的弱抑制剂。最初,人们仿照其结构合成了一系列衍生物,如苯甲酰胺( 化合物2) 3-氨基苯甲酰胺( 3-AB,化合物3) 及苯甲酰胺衍生物等。当3-AB 与放化疗联用时,虽可以增强杀伤肿瘤细胞的效果,但是摄入量达毫摩尔级时就会影响机体功能如葡萄糖代谢、细胞存活等且毒性较大。后研究发现,当在苯环上连接咪唑团时,酰胺键中的N端活泼H 通过分子内氢键起到维持假双环作用,稳定与PAP-1 结合所需的反式构象。如UN1085( 化合物4 ) ,咪唑2 位上引入芳环时与PAP-1 Tyr889 Tyr907 有π-π 堆积作用,增强活性。当浓度为10 μmol·L-1时可与替莫唑胺( TMZ) 发生协同作用,虽然其化学致敏效果强,但水溶性较差而未能进入临床研究。艾伯维( AbbVie) 公司研制的veliparib( 化合物5ABT-888Ki = 5 nmol·L -1EC50 = 2 nmol·L -1) 是口服PAP-1 PAP-2 抑制剂,具有很好的抗肿瘤活性且R 构型生物利用度好。临床上多与TMZ、顺铂、卡铂、环磷酰胺等化疗药物联用,提升对肿瘤的杀伤效果,同时减少用量和不良反应。veliparib 和卡铂联用于三阴性乳腺癌患者的试验目前还处于Ⅲ期临床。veliparib 还可透过血脑屏障,用于治疗转移性脑瘤的研究已进入Ⅰ期临床。目前veliparib TMZ 联用治疗BAC1 /2 缺陷和转移性乳腺癌的Ⅱ期临床研究正在进行。虽然veliparib 是强效的小分子抑制剂,但是其苯并咪唑部分易发生氧化代谢,导致生物利用度降低。当引入一个F 原子就可以有效的影响构象、膜通透性、代谢途径和药动学性质。在此基础上Wang等设计了一系列化合物,其中苯并咪唑( 化合物6) 4 位胺甲酰基与Ser243Gly202 His201 形成3种氢键,F 原子的引入与Ser243 的羟基部分有额外的氢键作用。这个关键的氢键可以增强PAP-1 活性位点和氨基酸残基相互作用。此外,苯并咪唑环与Tyr246 Tyr235 有π-π 相互作用。化合物7 2 位上连吡咯烷活性较低,而化合物6 上增加了一个甲基表现出较好的活性( IC50 = 57 nmol·L-1) ,表明甲基对PAP-1 酶抑制活性有帮助。接着对吡咯烷进一步改造,当吡咯烷N 上接取代基时,活性降低。而连接哌啶( 化合物8) 活性较好( IC50 = 29 8nmol·L-1 ) 。当用苯环代替哌啶,且苯环对位接上吗啉( 化合物9) 或者哌嗪( 化合物10) 时,表现出较好活性, IC50值分别为21 8 43 7 nmol·L -1。在进一步的HCT116 细胞实验中,化合物8 表现出与veliparib 相似的酶活性,而化合物9 ( 27 μmol·L-1 ) 、化合物10 ( 7 4 μmol·L -1 ) 的抑制活性分别是veliparib 2 3 倍和6 8 倍。在A549 细胞系中,化合物8、化合物9、化合物10 TMZ 联用均可增强细胞毒性,PF50值分别为1 92 3 1 6。化合物10 表现出的强抑制效果值得进一步研究。

当用五元氮杂环取代咪唑环得化合物11,其药动学性质良好, IC50值为24 nmol·L-1EC50值为3 7μmol·L-1。对化合物11 进行结构修饰得到MK-4827( 化合物12niraparib) IC50 = 3 8 nmol·L -1EC50 = 4 nmol·L-1) ,酶和细胞水平活性均有提高,侧链的引入使其水溶性大大提高。niraparib 作为口服的PAP-1 PAP-2 抑制剂,其生物口服利用度好,大鼠体内为41%。其S 构型细胞活性和BAC 选择性更好。2008 年进入临床试验阶段,在治疗HE2 缺陷的BCA 突变乳腺癌和对铂类化疗药物敏感的卵巢癌患者,Ⅲ期临床试验表现出色。口服niraparibqdPFS 21 个月,而安慰剂组为5 5 个月,延长近4 倍。除了在BAC 突变的患者中有优势,在非BAC 突变的患者中也有较好的效果( PFS 9 3 个月,对照组为3 9 个月) 2017 3 27 日,FDA 批准其用于复发性铂敏感上皮卵巢癌、输卵管癌或腹膜癌患者的维持治疗。

4 2 酞嗪酮类  Loh 等发现在酞嗪酮类化合物4 位引入苄基( 化合物13,见图4) 使抑制活性提高。并且苄基的间位取代有利于活性增强。当侧链苯环3 位上引入酰胺基( 化合物14) ,虽有较好抑制活性( Ki = 20 nmol·L-1 ) ,但是在体内代谢快。将酰胺环化成内酰胺( 化合物15) 时活性降低( Ki = 120nmol·L-1 ) ,但代谢稳定性增强。当引入丁二酰亚胺时( 化合物16) ,酶和细胞水平活性均提高( Ki =12 nmol·L -1) 比化合物14 活性增加10 倍,在4 位引入F 原子( 化合物17) ( Ki = 5 nmol·L-1) 可以增加膜通透性且活性提高2 倍。AstraZeneca( 阿斯利康) 公司研发的olaparib ( 化合物18AZD2281IC50 = 5 nmol·L-1 ) 用哌嗪基团代替丁二酰亚胺,其水溶性和生物利用度均提高。olaparib 作为口服PAP-1 PAP-2 的抑制剂,在2014 12 月获得FDA 加速批准以商品名Lynparza 上市,是全球第一个上市的PAP 抑制剂。它用于单药治疗经3 种或3 种及以上药物化疗的BCA 突变晚期卵巢癌。目前olaparib 用于对铂类化疗复发的晚期卵巢癌和BAC 缺陷的三阴性乳腺癌并处于Ⅲ期临床试验阶段,其与紫杉醇联合治疗胃癌也正在进行Ⅲ期临床。此外,对前列腺癌的治疗已经进入Ⅱ期临床阶段。当将酞嗪酮引入哌啶环,经过优化得到talazoparib(化合物19BMN-673 IC50 = 0 57 nmol·L-1) 是目前报道中最强的PAP-1 PAP-2 抑制剂,在DNA 上捕获PAP 的能力也是最强。虽然talazoparib进入临床试验最晚,但具有良好的生物利用度,口服剂量小。它与TMZ 或顺铂联用可以增强细胞毒性,但是会出现剂量依赖性。目前talazoparib用于治疗BCA 缺陷的乳腺癌正处于Ⅲ期临床阶段,而在治疗卵巢癌、前列腺癌、小细胞肺癌等实体瘤的研究都进入临床研究。E7449( 化合物20 IC50 =1 0 nmol·L-1 ) 作为单药用于恶性实体肿瘤、卵巢癌、晚期黑色素瘤等的治疗还处于Ⅰ或Ⅱ期临床。

4 3 三环吲哚内酰胺类  Pfizer 公司开发了三环吲哚内酰胺类化合物,七元环内酰胺结构( 化合物21见图5) ,保持了苯甲酰胺的反式构象,将其作为先导物对其进一步优化。当在2 位上引入苯环( 化合物22) 使其活性提高。在苯环上引入取代基时,对位比邻,间位有利,可能邻位或间位引入的基团阻碍了苯环的旋转从而使得与PAP-1 的结合力降低。为了提高溶解度,在苯环的对位引入饱和含N 基团得rucaparib(化合物23AG014699Ki =1 4 nmol·L-1) ,其环内酰胺与Gly863 Ser904 形成较强的氢键作用,苯环和吲哚母核与酪氨酸残基有π-π 相互作用。Rucaparib 是首个进入临床的PAP 抑制剂,也是第一个与TMZ 联用进行临床的PAP 抑制剂,并且是首个获得突破性治疗资格的药物。在rucaparib 用于BAC 突变的卵巢癌患者的Ⅱ期临床试验中,客观缓释率为40%,耐受性良好。2016 12 19日,FDA 加速批准了Clovis 公司的rucaparib( 商品名Rubraca) 上市,作为三线用药,治疗BAC 突变的晚期卵巢癌。目前rucaparib 与顺铂联用于BAC 缺陷的三阴性乳腺癌的治疗正处于Ⅱ期临床阶段。

Li 等设计了具有四杂氮苯并咪唑结构的环内酰胺( 化合物24) 。三环结构使得其通过3 种氢键最大限度的与PAP-1 活性位点结合。在咪唑C-2 位上也实现多样取代。在2 位上连接仲胺盐酸盐得到化合物25 表现出较好的抑制活性,其IC50值为54 nmol·L-1。表明在咪唑2 位上取代对于PAP 活性位点结合有利。基于这一点,进一步修饰得到化合物26,研究表明异丁基取代比正丁基取代的活性稍有降低。可能因为大基团取代对抑制活性不利,当2 位用苯环取代显示出较弱活性,但在苯环对位用哌嗪取代时( 化合物27) 抑制活性较好, IC50值为20nmol·L-1,活性是仅苯环取代的5 倍。在苯环对位连接烷基胺时不仅使得抑制活性保持,并且还能提升物理化学性能。化合物28 PAP-1 PAP-2 的抑制活性均在纳摩尔范围( IC50 = 11 nmol·L-19. 9nmol·L-1 ) 。在SW-620 MDA-MB-468 细胞中,化合物28 抗增殖效应均比veliparib ( 化合物28:EC50 = 23 6 μmol·L -1EC50 = 4 6 μmol·L-1; veliparib:EC50 =27 1 μmol·L-1EC50 =43 μmol·L-1 ) 。并且与TMZ 联用可增强细胞毒性。

4 4 其他  Papeo 等设计了一种具有异吲哚酮母核结构的NMS-P118( 化合物29,见图6) ,是一种具有高选择性且抑制活性强的PAP-1 抑制剂,与PAP-1 催化域的结合要高于PAP-2NMS-P118不管是作为单药还是与TMZ 联用于BAC1 突变的MDA-MB-436 细胞或BAC2 缺失的CAPAN-1 人类肿瘤细胞中,都表现出良好的药动学特性和抑制活性,且在小鼠和大鼠体内的口服生物利用度较高。NMS-P118 Olaparib 相比骨髓抑制毒性更低,作为PAP-1 选择性抑制剂有望进入临床研究。

Yuan 等设计合成的simmiparib( 化合物30,见图6) 模拟olaparib 结构,改变olaparib 环丙烷部分,在哌嗪上连接三氮唑结构得到的希明哌瑞不仅在体外表现出很强的抑制活性,在体内也有较好的抗肿瘤作用。其抑制活性大约是olaparib 2 倍,在H 缺陷的细胞内,希明哌瑞增加PAP-DNA 复合物的捕获,使DNA 双链损伤积累,停滞在G2 /M期最终导致H 功能缺陷的细胞凋亡。希明哌瑞抑制PAP-1 的活性IC50值为0 74 nmol·L-1PAP-2IC50值为0 22 nmol·L -1,是抑制PAP 家族其他成员的90 倍以上。在BAC1 缺失的MDA-MB-436细胞中,希明哌瑞表现出良好的药动学特征。20163 月, simmiparib 被批准进入临床实验,目前希明哌瑞片用于晚期恶性实体瘤治疗的安全性、耐受性及药动学特性的研究正处于Ⅰ期临床阶段。He等还设计合成盐酸美呋哌瑞( 化合物31MPH)具有苯并呋喃结构。盐酸美呋哌瑞是一种水溶较好( 大于35 mg·mL-1,是olaparib 水溶性的350 ) 的、高效的PAP-1 PAP-2 抑制剂,并可做成普通片剂。其对PAP-1 的抑制活性IC50值为3 2 nmol·L-1,是抑制PAP 其他家族成员的406 倍,并且具有良好的药动学特性,易于透过血脑屏障和较好的稳定性。MPH 的生物利用度大约是40% 100%,在大鼠体内,其在组织中的浓度是血浆浓度的33 倍。MPH 已于2016 11 月获得临床试验的批准,相信不久将会进入临床研究。

5 结语

PAP 的发现到以PAP-1 PAP-2 为靶点抗肿瘤药物的上市已过去50 余年,尽管这期间对PAP 抑制剂的研究经历了大起大落,但其显著的抗肿瘤活性仍吸引越来越多的研究者关注。目前,除了2014 年上市的olaparib rucaparib niraparib也在近期先后获得上市批准,而我国对PAP 抑制剂的研究虽起步较晚,但也相继进入Ⅰ期临床试验。虽然PAP 抑制剂有着广阔的发展前景,但仍旧存在一些问题需要解决,比如: PAP 抑制是作为单药使用,还是进行联合治疗需要进一步的探索。② 虽然PAP 抑制剂的捕获能力越强越有利于临床抑制效果,但对正常组织的活性毒性是首要考虑的问题。目前有研究表明PAP 抑制剂对正常组织DNA 产生积累性损伤,所以药物的安全性还需要观察。③ 上市的PAP 抑制剂如olaparib 等,难以透过血脑屏障,水溶性小等问题还需要纳入新的PAP 抑制剂的设计考虑。④ PAP 抑制剂虽然特异性靶向H 缺陷的细胞,但是也会产生耐药性。其原因可能是缺失功能的修复,还需要对PAP 抑制剂的作用和机制深入探索,设计出具有新构型的PAP 抑制剂。相信其在肿瘤治疗方面将会发挥更加重要的作用。

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