丹参茉莉酸甲基转移酶蛋白表达和纯化的研究

2016-12-05

茉莉酸 (JA) 及其衍生物茉莉酸甲酯 (MeJA) 统称为茉莉酸类物质 (jasmonates, JAs), 是一类在植物界中广泛存在的由脂类自由基氧化而来的脂氧化物。JAs 作为一种重要的内源性信号分子, 在植物防御生物和非生物胁迫反应及植物的生长和发育过程中扮演着重要的角色。MeJA 这种小分子脂类化合物具有挥发性, 可以通过空气传播而引起或激活未受损组织、器官和相邻植物间的防御反应, 所以在茉莉酸信号的传导过程中MeJAJA 更高效。从JA MeJA只需要通过甲基化就能迅速转化而来, 而茉莉酸甲基转移酶 (jasmonic acid carboxyl methyltransferase,JMT) 是催化JA 甲基化衍生为MeJA 的关键酶。

甲基转移酶类家族是近年来发现的在植物体内普遍存在的一类新家族, 常见的如JMT、水杨酸甲基转移酶 (salicylic acid carboxyl methyltransferase,SAMT) 和苯甲酸甲基转移酶 (benzoic acid carboxylmethyltransferase, BAMT) , 一些最新的研究成果表明该家族的酶能够以S-adenosyl-L-methionine 为甲基供体将底物中的羧酸类基团作为受体从而催化形成小分子的甲酯类化合物, 这些化合物可作为激活植物体内抵抗外界侵食、调节细胞周期、诱导防御反应的信号分子。研究发现将JMT 在马铃薯(Solanum tuberosum) 中过表达, 会引起转基因的马铃薯块茎变大, 产量增加[6]; 在人参 (Panax ginseng)中过表达, 会刺激人参根的生长及次生代谢产物人参皂苷的异质化等。Qi [8]还发现水稻 (Oryzasativa) 中的茉莉酸甲基转移酶 (OsJMT1) 可以通过改变JA 水平及相关的代谢产物, 从而调控植物发育,激活抵御食草动物侵食等防御反应。由此可见JMT在植物次生代谢产物的生物合成途径中起着非常重要的调控作用。

近年来研究表明, 丹参中的丹参酮和丹酚酸类物质的生物合成同样受JAs 物质调节和控制, Ma [9]发现丹参酮生物合成途径相关的40 个基因大多在MeJA 诱导24 h 后表达量增加。Wang [10]研究表明MeJA 可以诱导丹参毛状根中的丹参酮类物质积累增加。Gao 等通过酵母和银离子诱导丹参毛状根转录组分析发现, 茉莉酸甲基转移酶基因在酵母和银离子诱导12 h 后表达量大幅度增加, 且与丹参酮生物合成途径中相关基因的表达量增加呈正相关, 说明JMT 在诱导丹参酮生物合成中起重要作用。本研究将已克隆的丹参SmJMT cDNA 构建到原核表达载体pGEX-4T-1 , 转化大肠杆菌BL21 (DE3),选取阳性菌斑鉴定, 进行诱导表达, 并对其诱导条件进一步优化, 采用超声破碎的方式获得粗蛋白液, 利用Glutatione Agarose Beads 进行亲和纯化, Westernblotting 验证SmJMT1 在大肠杆菌中表达成功, Q-TOF检测分析表明, SmJMT1 属于甲基转移酶亚家族成员。丹参SmJMT1 基因在大肠杆菌中的成功表达纯化,为探究该基因对JA 生物合成途径及JA 对植物次生代谢调控奠定了一定基础。

材料与方法

材料 植物RNA 提取试剂盒购自北京华越洋生物科技有限公司; 10 mmol·L?1 dNTPRiboLock RNaseInhibitorRevertAid Reverse Transcriptase 购自赛默飞世尔科技 (中国) 公司; 原核表达载体pGEX-4T-1 为本实验室所保存; T4 DNA 连接酶购自Promega 公司;转化菌株E. coli DH5α 和表达宿主细胞BL21 (DE3)购自北京全式金生物技术有限公司; 异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)、氨苄青霉素 (Amp) 购自Sigma 公司;限制性核酸内切酶、预染蛋白Marker 购自NEB 公司;原核表达所用的非预染蛋白Marker 购自Fermentas 公司; Glutathione Agarose Beads 购自GE 公司; GST-Tag单克隆抗体、HRP-羊抗小鼠二抗及ECL 超敏发光液购自华兴博创公司; 其他试剂均为分析纯; 引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

pGEX-4T-SmJMT1 原核表达载体的构建和鉴定通过分析丹参转录组数据库序列, 设计带限制性内切酶位点的引物 (上游引物: 5'-cgcggatccATGGAAGTTCAAGTGCTTC, 下游引物: 3'-acgcgtcgacATCCTCTCCGGATCACTG)。用植物RNA 提取试剂盒提取RNA, 通过3' RACE 获得丹参的cDNA 模板, 克隆获得 SmJMT1 基因。以pGEM-T-SmJMT1 质粒为模板进行扩增, 回收PCR 产物, BamHⅠ和SalⅠ对PCR 产物和pGEX-4T-1 分别进行双酶切, 切胶回收目的片段与线性化pGEX-4T-1 载体片段, T4 DNA连接酶22 ℃、15 min 连接。将连接产物转化E. coliDH5α, 涂布在含Amp LB 固体培养基上37 ℃培养过夜。挑取单克隆进行菌液PCR 检测。涉及到的验技术均参考文献[12, 13]。用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定分析, 1.5% 的琼脂糖电泳检测插入片段的大小,并对重组质粒pGEX-4T-SmJMT1 进行测序鉴定。

重组蛋白 SmJMT1 的原核表达及条件优化 挑取阳性重组菌的单菌落, 接种于2 mL Amp LB液体培养基中, 37 ℃活化过夜后, 按照150 比例接种, 250 r·min?1 振摇至生长对数期A600 0.8, 加入终浓度为0.4 mmol·L?1 IPTG 20 ℃诱导表达。设置诱导时间、诱导温度、IPTG 浓度及诱导时宿主菌的A600 4 个因素, 保持其中的3 个因素不变, 分别考察单一因素变化对重组蛋白SmJMT1 表达的影响, 从而确定获得重组蛋白的最佳方法。诱导表达结束后,1 mL 菌液, 4 ℃、12 000 r·min?1 离心5 min, 收集菌体; 用去离子水洗涤两次; 加入60 μL 2×SDS 上样缓冲液, 煮沸10 min; 4 ℃、12 000 r·min?1 离心1 min; 取上清10 μL 上样。配制15%的分离胶和 5%的浓缩胶,进行SDS-PAGE 凝胶电泳检测分析。

重组蛋白 SmJMT1 的纯化 根据上述优化条件诱导重组蛋白SmJMT1 表达, 收集菌体低温超声破碎提取粗蛋白, 取上清液, Glutathione Agarose Beads纯化粗蛋白, 10 kDa 的浓缩柱 (Millipore 公司) 浓缩纯化后的样品, 最后进行SDS-PAGE 凝胶电泳检测, 并在595 nm 处利用Bradford 方法检测其浓度。重组蛋白SmJMT1 的蛋白印迹 纯化蛋白经SDS-PAGE 凝胶电泳分离后, 通过湿转法转到PVDF膜上, 转化完全的膜, 100%的甲醇漂洗 2 , 然后将膜转移至5% 脱脂牛奶中, 孵育1 h, PBS-T 0.3%Tween 200 冲洗3 ; 5%脱脂牛奶加一抗的混合液孵育1 h, 接着用PBS-T 冲洗3 ; 再用5%脱脂牛奶加HRP 标记的羊抗小鼠二抗孵育1 h, 最后用PBS-T 漂洗3 次。吸干水分后, ECL 超敏发光液孵育, 进行显影。

重组蛋白 SmJMT1 的二级质谱分析[15] 纯化蛋白经SDS-PAGE 凝胶电泳分离后, 考马斯亮蓝染色,脱色, 选取目的条带切胶, 回收至1.5 mL 的离心管中,ddH2O 清洗10 min, 重复1 , 加入消化脱色液清洗10 min, 重复1 , 加入乙腈脱水至胶粒完全变白,真空抽干乙腈, 加入10 mmol·L?1二硫苏糖醇孵育1 h,加入碘乙酰胺孵育45 min, 加入25 mmol·L?1 碳酸氢铵清洗10 min, 重复1 , 加入乙腈脱水至胶粒完全变白, 真空抽干乙腈, 加入酶储液消化过夜, 0.1%的甲酸终止消化, 10 μL 的样品上机, 使用质谱仪MicrOTOF-QII (Bruker Daltonics) 检测。

Q-TOF 的条件: 液相: prominence nano 2D(Shimazhu); 柱料: C18, 5 μm, 150 A (Eprogen); A :0.1%甲酸水溶液, B : 0.1%甲酸乙腈溶液; 梯度洗脱 (04 min 5% B, 430 min 5%40% B, 3035min 40%80% B, 3545 min 80% B, 4545.1 min5% B, 45.160 min 5% B), 流速: 400 nL·min?1。质谱仪器: MicroTOF-QII (Bruker Daltonics); 数据采集软件: Bruker Daltonics MicrOTOF control; MS-MS 扫描范围: 502 200 m/z, 碰撞气体: 氩气; 毛细管电压:1 500 V; 干燥气体温度: 150 ℃。

数据库检索: 数据分析软件: Data Analysis Software;数据搜索: Mascot search engine version 2.3.01;提取质谱数据, 利用Data Analysis 软件标峰后, 进行MASCOT 搜索, 获取结果。

结果与分析

1 pGEX-4T-SmJMT1 原核表达载体的构建用分别带有限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ的SmJMT 基因上下游引物, 扩增丹参SmJMT1 cDNA(GenBank 登录号: KX433005), PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离, 1 000 bp 附近有一条清晰的条带 (1a), 与预期的目的条带1 083 bp 大小一致。用 BamHⅠ和SalⅠ对带有酶切位点的PCR 产物和原核表达载体pGEX-4T-1 分别进行双酶切, 切胶回收目的片段与线性化pGEX-4T-1 载体片段, T4DNA 连接酶连接, 转化E. coli DH5α, 挑单克隆菌体摇菌, 进行PCR 检测, 提取阳性重组质粒。

 

将重组质粒pGEX-4T-SmJMT1 BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定, 出现两条带, 泳道1 中第二条条带的大小约1 000 bp (1b), SmJMT1 基因的大小相近。测序结果显示与目的基因的序列一致,说明已经成功将SmJMT1 基因构建到原核表达载体pGEX-4T-1 上。

2 重组蛋白SmJMT1 的诱导表达

将构建好的 pGEX-4T-SmJMT1 质粒转化到表达菌株BL21 (DE3), 加入适宜浓度的IPTG 诱导表达。取1.0 mL的诱导菌液, 离心弃上清, 加入60 μL2×SDS Loading Buffer 混匀煮沸10 min, 冰浴2 min, 离心, 取上清5 μL 点样进行SDS-PAGE 凝胶电泳分析。在约66 kDa 处出现目的条带, SmJMT1 基因的cDNA编码361 个氨基酸, 推测蛋白分子质量为40.43 kDa,而原核表达载体pGEX-4T-1 GST-Tag 标签的大小为26 kDa, 所以重组蛋白大小约为66.43 kDa。但是阴性对照空载体pGEX-4T-1 诱导表达后在26 kDa 有条带, 而在66.43 kDa 处没有条带出现 (2)。以上结果表明含有SmJMT1 基因的重组质粒, 在大肠杆菌中已成功表达。

pGEX-4T-1 上。2 重组蛋白SmJMT1 的诱导表达将构建好的 pGEX-4T-SmJMT1 质粒转化到表达菌株BL21 (DE3), 加入适宜浓度的IPTG 诱导表达。取1.0 mL的诱导菌液, 离心弃上清, 加入60 μL2×SDS Loading Buffer 混匀煮沸10 min, 冰浴2 min, 离心, 取上清5 μL 点样进行SDS-PAGE 凝胶电泳分析。在约66 kDa 处出现目的条带, SmJMT1 基因的cDNA编码361 个氨基酸, 推测蛋白分子质量为40.43 kDa,而原核表达载体pGEX-4T-1 GST-Tag 标签的大小为26 kDa, 所以重组蛋白大小约为66.43 kDa。但是阴性对照空载体pGEX-4T-1 诱导表达后在26 kDa 有条带, 而在66.43 kDa 处没有条带出现 (2)。以上结果表明含有SmJMT1 基因的重组质粒, 在大肠杆菌中已成功表达。

3 重组蛋白SmJMT1 表达条件的优化

3.1 诱导时间对SmJMT1 蛋白表达的影响 改变取样的时间, 保持诱导温度20 , IPTG 的诱导浓度0.2mmol·L?1 及诱导前菌液的浓度不变, 探究诱导时间对SmJMT1 蛋白表达的影响, 在加入IPTG 诱导后不同时间点024681012 h 分别取样, 结果显示诱导时间对该蛋白的表达有较为明显的影响, 2 h 时该蛋白已有很明显的表达, 其表达量随着时间增加而呈现逐渐增加的趋势, 8 h 时蛋白的表达量达到最大, 随后蛋白的表达量有减少的趋势 (3)

3.2 诱导温度对SmJMT1 蛋白表达的影响改变

诱导温度, 保持诱导时间8 h, IPTG 的诱导浓度0.2mmol·L?1 及诱导前菌液的浓度不变, 探究诱导温度对SmJMT1 蛋白表达的影响, 即在20253037 ℃分别诱导蛋白表达, 观察到诱导温度对蛋白表达的影响不明显, 在这4 个不同的温度下重组蛋白均可以得以很好地表达, 而低温20 ℃的情况下该蛋白的表达量相对较好 (4)

3.3 IPTG 浓度对SmJMT1 蛋白表达的影响 改变

IPTG 的浓度, 保持诱导温度20 , 诱导时间8 h 及诱导前菌液的浓度不变, 探究IPTG 浓度对SmJMT1 蛋白表达的影响, 加入IPTG 的终浓度分别为0.10.20.40.60.81.0 mmol·L?1, 从实验结果可以观察到IPTG 在低浓度0.1 mmol·L?1 , SmJMT1 蛋白的表达已经很明显, 随着IPTG 浓度的增加其蛋白的表达量呈现先增后减的趋势, 当终浓度为0.4 mmol·L?1 时蛋白的表达量最高 (5)

3.4 诱导前菌液浓度对SmJMT1 蛋白表达的影响

依据 3.13.3 的实验结果, 保持诱导温度20 , 诱导时间8 h, IPTG 的诱导浓度0.4 mmol·L?1 不变, 将过夜培养的菌液按照150 的比例转接后, 分别在011.5246 h 测其在600 nm 处的吸光度, 并且添加IPTG 诱导表达, 从实验结果可以观察到不同的诱导前菌液浓度对SmJMT1 蛋白的表达量有很明显的影响。刚转接0 h 时测得其菌液的A600 0.180, 此时添加IPTG 诱导该蛋白几乎不表达, 但随着培养时间的增加, 随后添加IPTG 诱导, 其蛋白的表达量也呈现先增后减的趋势, 尤其是转接2 h 时添加IPTG 蛋白的表达最明显, 此时A600 0.885, 当转接11.546 h 时测得其菌液的A600 分别为0.2550.4061.9362.236, 这表明诱导前菌液的A600 0.8 附近时蛋白的表达量较高 (6)

4 重组蛋白SmJMT1 的纯化和浓缩

根据上述优化条件, 诱导适量的菌液, 收集菌体,加入一定量的PBS 缓冲液洗涤23 , 将获得的菌体称重, 15 比例加入PBS 缓冲液重悬菌体, 低温超声裂解破碎至菌体呈透明状, 离心, 取上清液进行SDS-PAGE 凝胶电泳检测, 发现该蛋白在上清液中表达, 表明SmJMT1 重组蛋白可溶。

对上述所提取的蛋白, Glutathione AgaroseBeads 纯化, 10 kDa 的浓缩柱浓缩纯化后的蛋白,然后进行SDS-PAGE 凝胶电泳检测和浓度测量, 结果如图7 所示, 可见纯化后的杂蛋白含量明显减少, 说明纯化效果良好。

5 重组蛋白SmJMT1 的蛋白免疫印迹

取上述纯化的蛋白, 进行SDS-PAGE 凝胶电泳分离, 接着冰浴转膜, GST-Tag 一抗和HRP-标记的羊抗小鼠二抗孵育后, 显影, 如图所示 (8), anti-GST抗体可以特异性地识别重组蛋白SmJMT1, 说明SmJMT1 蛋白在大肠杆菌中已成功的表达。

6 重组蛋白SmJMT1 的二级质谱分析

切取SDS-PAGE 凝胶电泳约66 kDa 附近的胶粒, 通过Q-TOF 检测, 提取质谱数据, 利用DataAnalysis 软件标峰后, 进行MASCOT 搜索 (Mascotsearch)。参考Q-TOF 数据分析的文献[16], 按表1 和表2 的参数筛选检索结果, 发现数据库中存在两个已知的JMT 的相似序列, 丝氨酸羟甲基转移酶 (serinehydroxymethyltransferase) 和氨甲基转移酶 (aminomethyltransferase),序列号为A8GHZ4 A8GIS1。通过评估离子得分 (ions score), 选取与其相匹配

2 的参数筛选检索结果, 发现数据库中存在两个已知的JMT 的相似序列, 丝氨酸羟甲基转移酶 (serinehydroxymethyltransferase) 和氨甲基转移酶 (aminomethyltransferase),序列号为A8GHZ4 A8GIS1

通过评估离子得分 (ions score), 选取与其相匹配的肽段谱图 (9)。从NCBI 数据库中下载其氨基酸序列, Blast 分析比对, 发现SmJMT1 的氨基酸序列与其相似, 均属于甲基转移酶这一亚家族, 具有相同的活性位点。由此推测, 其可能具有相似的功能, 能够催化JA 甲基化转化为MeJA

讨论

2001 , Seo 等首次从拟南芥中克隆到了JMT基因, 并研究了该基因的功能, 结果表明JMT 不仅可以催化JA 形成MeJA, 同时还能接收或响应一些由外界刺激而引起的局部或系统信号, MeJA 自身就是一种植物防御的内源性信号分子, 与植物体内的防御反应密切相关, 所以JMT 是公认的植物体内茉莉酸生物合成过程的关键酶。目前已在许多植物中克隆得到了JMT 基因, 并且在马铃薯、人参、水稻[8]、番茄 (Solanum lycopersicon)[17]、欧洲大叶杨(Populus trichocarpa) [18]等几种植物体内过表达JMT基因, 结果表明, JMT 可通过正反馈或负反馈来调控植物体内的次生代谢过程。

大肠杆菌作为外源基因表达的受体菌, 均具备遗传背景清楚、遗传稳定、基因克隆表达系统成熟完善、培养简单、繁殖迅速、操作方便等优势, 但其融合蛋白表达过程还受多种因素的影响, 如载体的类型、菌株的状态、诱导的条件等。在本次实验原核表达的载体构建过程中, 同时构建了pET-28apET-32a pGEX-4T-1 三种载体, 并转入到了E. coli BL21 (DE3)E. coli Transetta (DE3) 两种菌株中, 筛选了适合SmJMT1 蛋白表达的载体和菌株, 结果发现将SmJMT1基因构建到pGEX-4T-1 的载体上, 转化E. coli BL21(DE3) 是获得可溶性SmJMT1 蛋白最有效的方法。研究表明, 诱导温度对SmJMT1 蛋白表达量的影响不是很明显, 但是为了在低温诱导下增加蛋白的溶解性, 最终选择20 ℃诱导。随着诱导时间的增加, 蛋白的表达量呈现先增后减的趋势, 8 h时达到最大, 8 h 后减弱但趋势并不明显, 这可能是由于蛋白表达局部浓度过高, 抑制了后续菌体自身的生长, 甚至使部分蛋白降解。IPTG 的浓度对其表达量也有一定的影响, 相关文献报道IPTG 0.10.2 mmol·L?1时蛋白表达量相对较高, 本次实验过程中却发现IPTG 浓度在0.4 mmol·L?1 , SmJMT1蛋白的表达量最高。诱导前菌液的浓度对蛋白的表达影响也较为明显, 菌液浓度过低或过高都不利于蛋白的大量表达。这可能是因为菌体只有在对数生长期, 其生长状态才最好, 有利于蛋白的表达, 在停滞期和衰老期菌体自身的生长状态受限制, 所以蛋白的表达量明显较低。

获得 SmJMT1 可溶性蛋白是蛋白纯化的关键, 本次实验过程中采用低温超声破碎技术, 4 ℃离心, 在上清液中获得了SmJMT1 蛋白。该蛋白质经纯化、浓缩、SDS-PAGE 凝胶电泳检测, 结果如图7 所示, 66 kDa 附近存在一条单一且明显的目的条带, Western blotting 结果 (8) 66 26 kDa 附近分别有SmJMT1pGEX-4T-1 的特异性条带, 与此同时还出现了其他与抗体非特异性结合的条带。这可能是由于Glutathione Agarose Beads 受自身结构限制, 与目的蛋白结合的同时, 也会与重组蛋白菌液中的其他蛋白相结合, 想要获得完全纯化的单一蛋白, 后续还需要过蛋白凝胶阻滞分离柱。但由于这些非目的蛋白浓度较低, 条带不明显, 未影响实验结果, 所以未进行分离。

Mascot 搜索是通过评估离子得分来鉴定其是否与数据库中特定的肽段离子光谱相匹配。本次数据分析时依据P 值理论, 离子得分> 34 即可认为此肽段序列可鉴别, 反之则认为P < 0.05, 序列之间只存在广泛的同源性[24]。因此, 选取了实际检测到的肽段分子质量与期望分子质量和计算分子质量之间质量偏差小、肽段得分高、可信度评估好、肽段排名为1的特异性肽段, 通过a-型、b-型或y-型离子模型与数据库中已存在的离子光谱相比对来识别离子碎片,探索其与已发现的蛋白质之间的关系或确认其是否为新的蛋白序列。

丹参茉莉酸甲基转移酶 (SmJMT1) 在大肠杆菌中成功表达, 为进一步深入研究茉莉酸信号通路与丹参酮类化合物等次生代谢产物的生物合成相关性奠定了一定基础。

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