脑肿瘤靶向肽T7 修饰的纳米结构脂质载体的制备和表征

2019-04-24

脑胶质瘤是常见的神经系统原发性肿瘤,多呈恶性,患者的中位生存期不足16 个月。由于脑胶质瘤的高度侵袭性,手术难以完全切除,从而极易复发;而放射治疗也不能全部杀死癌细胞,并且不良反应大,容易导致放射性痴呆; 化疗不良反应严重,而且容易产生耐药性等问题。所以在手术、放化疗等常规手段不能有效治疗脑胶质瘤的情况下,基因治疗( gene therapy) 的出现给脑胶质瘤的治疗提供了一个新的途径。目前基因药物如小干扰RNA( small-interferingNAsiNA) 等已在临床前研究中显示了较好的治疗效果和广阔的应用前景。然而,由于血脑屏障( blood brain barrierBBB) 阻碍了超过98%的小分子和几乎全部的大分子药物进入脑内,从而使得很多原本对外周系统肿瘤有良好治疗效果的药物对脑胶质瘤治疗无效。此外, siNA 易降解,而且由于细胞膜的同性电荷排斥作用和肾过滤作用,使得siNA必须借助载体运输才能有效的转染入靶细胞内。因此,设计并构建能够有效进入脑部的基因药物递送系统一直是药剂学的热点研究领域之一。

多种受体在脑肿瘤细胞和脑毛细血管内皮细胞上高表达,如转铁蛋白受体( transferrin receptorTf) 等。如果将对应的配体作为靶向功能分子修饰在药物载体系统上,就能借助配体与相应受体的特异性结合介导药物转运,跨越BBB 并到达肿瘤细胞内。T7 ( CHAIYPH) 是一种通过噬菌体展示技术筛选得到的短肽,能够与Tf 特异性结合,结合常数高达10 nmol·L-1,并且由于结合位点的不同,内源性的转铁蛋白不会抑制反而会促进T7 肽修饰的纳米粒与Tf 特异性结合,所以T7 肽比较适合作为脑靶向功能分子。纳米结构脂质载体( nanostructured lipid carriersNLC) 是在固体脂质纳米粒的基础上发展而来的第2 代脂质纳米粒。其采用混合脂质为载体材料,将液态脂质混合到固体脂质中制备而得,增加了纳米粒的稳定性,降低储存过程中药物泄漏率的问题。由于其独特的物理结构,阳离子纳米结构脂质载体可以与荷负电的siNA 通过静电作用形成siNA/NLC 复合物,增加了siNA 稳定性。

针对临床上对脑胶质瘤治疗的迫切需要,本研究将T7 修饰到NLC 表面上( T7-NLC) ,以期利用T7的双极靶向能力( 血脑屏障/脑肿瘤) ,提高包载siNA NLC 对脑肿瘤的靶向治疗能力。本研究首先合成了功能材料T7-PEG2000-DSPE。接下来,以小鼠脑毛细管内皮细胞( bEnd 3 细胞) 和小鼠源脑胶质瘤细胞( C6 细胞) 分别代表脑毛细血管内皮细胞和脑胶质瘤细胞,构建了bEnd 3 /C6 细胞共培养模型,以跨越bEnd 3 细胞后进入C6 细胞内的T7-NLC 的量为考察指标,优化了T7-PEG2000-DSPE NLC 中的用量,并对较优处方进行了表征。

材料与方法

1 试药

T7 ( 上海如吉生物科技有限公司) ; siNA FAM-siNA( 上海吉玛制药技术有限公司) ; 单硬脂酸甘油酯( 德国BASF 公司) ; 注射用大豆油( 日本和光纯药株式会社) ; 大豆卵磷脂( SPC,德国Lipoid公司) ; 双十烷基二甲基溴化铵( DDAB,阿拉丁公司) DSPE-PEG2000-Mal( 美国Avanti 公司) ; 三氯甲烷( 国药集团化学试剂有限公司) ; 胎牛血清( 浙江天杭生物科技股份有限公司) ; DMEM 培养基、1640培养基( 美国Thermo Fisher Scientific 公司)

2 仪器

E52CS 旋转蒸发器( 上海亚荣有限公司) ;7500 透射电子显微镜( 日本Hitachi 公司) ; MalvernZeta Sizer 3000HS 激光粒度仪/Zeta 电位分析仪( 英国Malvern 公司) ; JY92 IID 细胞超声破碎仪( 宁波新芝生物科技有限公司) ; F 5301 荧光分光光度计( 日本岛津公司)

3 T7-PEG2000-DSPE 的合成

精密称取DSPE-PEG2000-Mal 粉末置于茄型瓶中,用适量氯仿溶解,于40 ℃减压干燥1 h 得干燥脂膜。将该脂膜用pH 6 5 HEPES 缓冲盐溶液10 mL 水化,涡旋,40 ℃水浴超声10 min,得到脂材胶束体系。另取多肽T7( CHAIYPH) 溶于上述pH6 5 HEPES 缓冲盐溶液10 mL 中备用。将制备的脂材胶束溶液缓慢滴加到多肽溶液中[多肽∶ 脂材,( mol mol) = 1 1 25],充氮保护,室温避光反应8 h。反应结束后,所得体系以双蒸水避光透析( MWCO 25KD) 24 h。取少量样品进行核磁共振氢谱( 1H NM) 和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱( MALDI-TOF MS) 鉴定,其余样品冷冻干燥后得到产物,- 20 ℃保存备用。

4 载体的制备

采用熔融-超声法制备T7 修饰的纳米结构脂质载体( T7-NLC)。取处方量的单硬脂酸甘油酯、注射用大豆油、SPC T7-PEG2000-DSPE 溶解于5 mL的乙醇中形成有机相。将处方量的DDAB( 0 15%w /v) 溶于10 mL 双蒸水中。500 r·min-1搅拌,于70 ℃条件下将有机相逐滴加入水相中,持续搅拌4 h,得半透明的初乳。将该初乳进行超声分散,冰浴中固化1 h,即得T7-NLC

取适量的siNA( 10 μmol·mL-1,经DEPC 处理的5%葡萄糖水溶液配制) T7-NLC 混合均匀,在室温下孵育30 min,即得包载siNA T7-NLC( siNA/T7-NLC 复合物) 。为了更方便地测定包封率以及考察细胞对T7-NLC 的摄取情况,制备了包载FAM-siNA ( 荧光标记的siNA) T7-NLC( FAM-siNA/T7-NLC 复合物) ,具体方法与siNA/T7-NLC 复合物的相同。

5 筛选T7-PEG2000-DSPE NLC 中的用量

5 1 体外BBB 模型的建立 按照文献报道的方法,细胞插入器以2%明胶D-Hank's 溶液包被后,每个插入器( 0 4 μm 孔径、12 mm 直径、1 12 cm2 表面积) 中接种1 × 105 bEnd 3 细胞,培养6 d,每2 d 更换一次培养基。

5 2 体外BBB 模型的评价 在显微镜下观察到bEnd 3 细胞汇合后,将培养基加到细胞插入器上室中,造成插入器上下室形成液面差( 内高外低) ,使上下室液面差大于0 5 cm,静置并观察液面差的变化情况,若此液面差能维持4 h 以上,说明脑毛细血管内皮细胞已经形成了紧密连接。用电阻仪检测插入器内外两侧的跨细胞电阻值( transendothelialelectrical resistanceTEE) 。当TEE 高于200 Ω·cm2后,并且液面差能够保持4 h 以上不变,表明体外BBB 模型建立成功。

5 3 bEnd 3 /C6 细胞共培养模型的建立 bEnd 3细胞种入细胞插入器上室中,然后于d 4 在下室种入每孔2 000 C6 细胞,分别加入培养基,2种细胞共培养24 h 后用于实验。

5 4 跨越体外BBB 后对脑胶质瘤细胞的摄取 利用bEnd 3 /C6 细胞共培养模型,分别考察T7-PEG2000-DSPE 的用量为0%1%2%4%6% 8%T7-NLC C6 细胞的摄取情况。游离FAMsiNA作为对照组。向Transwell 上室中加入不同T7-PEG2000-DSPE 用量的T7-NLC( 用培养基调整脂质浓度为0 4 μmol·mL-1) 和游离FAM-siNA,在37 5%CO2孵箱中培养8 h,用胰酶消化、离心、重悬Transwell 下室的C6 细胞后,采用流式细胞仪检测细胞摄取的T7-NLC 的荧光强度。

6 载体的表征

根据优化的处方,按照“4”中的方法制备T7-NLC

6 1 粒径和电位的测定 采用激光粒度仪/Zeta 电位分析仪测定T7-NLC 的粒径和Zeta 电位。仪器的激光束波长设定为633 nm,入射光与散射光束的夹角为90°,测定温度设定为25 ℃。每个样本测定3个循环时间,最后结果为3 次测定结果的平均值。多分散度( polydispersity indexPDI) 表示粒子大小的均匀程度,PDI 越小则粒子越均匀。同时测定T7-NLC Zeta 电位。

6 2 形态观察 分别采用透射电镜、原子力显微镜对T7-NLC 的形态进行观察。透射电镜观察: 取适量的T7-NLC 样品稀释至合适浓度,滴加在覆有支持膜的铜筛网上,2%磷钨酸染色,自然干燥后采用透射电镜观察其形态。原子力显微镜观察: 以离子水作为分散介质,将T7-NLC 样品稀释至合适浓度,滴加在硅片上,自然干燥后采用原子力显微镜观察其形态。

6 3 包封率测定 通过超速离心法测定游离的FAM-siNA 浓度,考察siNA/T7-NLC 复合物中siNA 的包封率。25 000 g( 4 ) 超速离心45 min,收集上清中未被包封的游离FAM-siNA,用全波长酶标仪测定总荧光强度和未被包封的游离药物的荧光强度。荧光分光光度计激发波长为490 nm,发射波长515 nm。根据以下公式计算脂质复合纳米粒的包封率( entrapment efficiencyEE%)

  EE% = ( siNA 游离siNA) /siNA ×100% 式       ( 1)

6 4 载体的稳定性考察 取siNA/T7-NLC 50 μL加入到1 mL PBS( pH 7 4) 中,混合后,密封好,备用。将该样品放置于4 8 ℃环境中,分别于制备的当天( d 0) 和制备后d 30 取样测定样品的粒径和电位,考察4 8 放置条件下siNA/T7-NLC 的稳定性。

7 血清稳定性考察

取游离siNA siNA/T7-NLC 按照1 1( v /v)与新鲜FBS 混合,在37 ℃条件下一起孵育进行评价。在预先设计好的时间点分别取等量样品,加入等体积1%Triton X-100 后,上样,通过1%琼脂糖凝胶电泳观察siNA 被RNA 酶降解情况。

8 数据处理

计量资料的数据以`x ± s 表示,两组间比较采用t 检验,P 0 05 为差异有统计学意义。

结果

1 T7-PEG2000-DSPE 的合成

T7-PEG2000-DSPE 的合成路线如图1A 所示,使用带有巯基( -SH) 的多肽T7 ( CHAIYPH) 与活性脂材DSPE-PEG2000-Mal 的马来酰亚胺基团( -Mal) 反应,该反应为典型的迈克尔加成反应。据此原理,该反应可以生成连有多肽的DSPE-PEG2000衍生物。整个反应在pH 6 5 HEPES 缓冲盐溶液中进行。

如图1B 所示,活性脂材DSPE-PEG2000-Mal 与多肽T7 反应后,MALDI-TOF 质谱中显示了明显的钟形分布峰,各响应峰间隔的相对分子质量为44 Da,为聚乙二醇( PEG) 结构中重复单元的特征。根据T7( 995 Da) DSPE-PEG2000-Mal( 2 893 Da) 的相对分子质量可得T7-PEG2000-DSPE 计算相对分子质量为3 888 DaMALDI-TOF 质谱图显示出对应的响应峰( 3 888 251 Da) 。利用1H NM 对反应产物的取得进行进一步确定。如图2C 所示,δ = 2 5 ppm为氘代DMSO 溶剂峰; δ = 6 5 7 5 T7 中苯的特征峰; δ = 3 4 ppm PEG 亚甲基重复单元的特征峰。MALDI-TOF 1H NM 均证明该反应产物即为目标功能性化合物。

2 T7-PEG2000-DSPE NLC 中的用量对细胞摄取的影响

为了实现最佳的跨越BBB 后进入脑胶质瘤细胞的效果,本研究对T7-PEG2000-DSPE 的用量进行了筛选。

2 1 体外BBB 模型评价采用跨膜电阻评价体外BBB 模型,测定体外BBB 模型的跨膜电阻在204 220 Ω·cm2。液面差能保持4 h 以上不变,并且电阻高于200 Ω·cm2,显示体外BBB 模型建立成功,可用于下一步研究。

2 2 跨越BBB 后对脑胶质瘤的摄取在成功建立了体外BBB 模型的基础上,建立了bEnd 3 /C6 细胞共培养模型并用于不同T7-PEG2000-DSPE 用量的T7-NLC 的体外双重靶向性评价( 2A) 。不同T7-PEG2000-DSPE 用量的T7-NLC 在跨越体外BBB 后对C6 脑胶质瘤细胞的摄取情况见图2B。结果显示:游离的FAM-siNA 和普通NLC ( 没有T7 修饰的NLC,即T7-PEG2000-DSPE 用量为0%) 由于不能跨越BBB,所以在C6 细胞中不能被检查到荧光强度。当T7-PEG2000-DSPE 用量从1%增加到4%时,C6 细胞对T7-NLC 摄取也在逐步增加。这主要是由于bEnd 3 C6 细胞都是Tf 高表达的细胞,T7 可以与Tf 特异性结合,因而T7-NLC 显示出了“双重靶向性作用”,即跨越血脑屏障后靶向转移至脑胶质瘤细胞中,且T7 用量越多,双重靶向能力越强。但是当T7-PEG2000-DSPE 用量增加到6% 时,与T7-PEG2000-DSPE 用量为4% 时相比,C6 细胞对T7-NLC 摄取并没有显著增加。这主要是由于bEnd 3 C6 细胞表面上的Tf 数量是有限的,与T7 特异性结合的Tf 已经饱和,即使再增加T7-PEG2000-DSPE 的用量( 8% ) 也不能促进细胞对T7-NLC 摄取。因此,选用T7-PEG2000-DSPE NLC 中的用量为4%

3 T7-NLC 的表征

按照T7-PEG2000-DSPE NLC 中的用量为4%的处方制备T7-NLC siNA/T7-NLC。如图3A( 透射电镜) 和图3B( 原子力显微镜) 所示, siNA/T7-NLC 颗粒圆整,粒径均一。siNA/T7-NLC 粒径、DPI Zeta 电位测定结果见表1。结果显示T7-NLCsiNA/T7-NLC 的平均粒径分别为( 104 13 ±2. 05) ( 112 61 ± 1 85) nmPDI 分别为( 0 252 ±0. 049) ( 0 277 ± 0 016) ,粒径分布均匀。此外,T7-NLC Zeta 电位为( 16 05 ± 1 03) mV,而siNA/T7-NLC Zeta 电位( 9 54 ± 0 86) mV,说明包载了荷负电的siNA 后,降低了体系的电位。在4 8 ℃条件下放置30 d siNA/T7-NLC 的粒径为( 113 18 ± 1 09) nmPDI 分别为( 0 282 ± 0 047) Zeta 电位为( 10 34 ± 0 86 ) mV,表明siNA/T7-NLC PBS 中稳定性良好。

TE( 10 mmol·L-1Tris-HClpH 8 01mmol·L-1EDTA) 缓冲液配制FAM-siNA 标准溶液,用荧光分光光度计在490 515 nm 处测定其荧光强度,得出回归方程为Y = 33 213X + 47 241( r2 = 0 999 3) FAM-siNA 浓度在2 20 nmol·L-1范围内与荧光强度线性关系良好。测定结果表明,siNA/T7-NLC的包封率较高,达( 80 56 ± 1 13) %( n = 3)

4 血清稳定性考察

电泳分析结果如图4 所示,游离siNA 组降解明显且呈现时间依赖性,8h 后已不可见完整泳带,相比而言siNA/T7-NLC 组中siNA 的完整性相对稳定,24 h 时间点仍可见明显的条带。实验结果表明T7-NLC 能较好地保护siNA 免受血清中核酸酶的降解,显著提高了siNA 的血清稳定性,有利于制剂的体内应用。

讨论

BBB 主要是由毛细血管内皮细胞特化形成的屏障系统,使大脑中有用的营养物质和代谢产物可以自由通过,并防止外界有害物质如病毒等进入大脑,这一特性也有利于维持脑内微环境成分的相对稳定,使中枢神经系统( central nervous systemCNS) 能保持正常的生理功能。一般情况下,小分子量的脂溶性药物( 400 600 Da) 容易通过BBB,而蛋白质、多肽等许多有价值的药物则难以突破BBB 进入CNS 发挥其治疗作用,因此BBB 也就成为脑部疾病治疗的主要障碍之一。

脑胶质瘤是危害人类健康的重要病症之一,高靶向和高效率的治疗药物一直是人们期待的目标。为了更好地杀伤脑胶质瘤细胞,构建既能靶向肿瘤组织,同时又能跨越BBB 的药物载体系统。特异的配体能够与脑胶质瘤和BBB 上具有介导转运系统的受体特异性结合,从而实现药物的有效转运和治疗。研究表明,Tf 在脑毛细血管内皮细胞和脑胶质瘤细胞上均高表达,而T7 Tf 的特异性配体,因此可以利用T7 实现对BBB 和脑胶质瘤细胞的双重靶向递送。本探究将多肽T7 通过化学合成连接到脂材DSPE-PEG 上得到功能性导向化合物T7-PEG2000-DSPE,在将其修饰纳米结构脂质载体。该修饰既可以实现纳米制剂在体内的长循环,同时能发挥靶向递送,提高体内传递效率的作用。马来酰亚胺基团中存在2 个与双键连接的羰基,易于受到亲核基团的攻击,如巯基。因此含有巯基的蛋白与马来酰亚胺功能化PEG 之间的迈克尔加成反应,被广泛应用于蛋白多肽类与聚合物的偶联。为了给多肽T7 引入了巯基,在保持T7 原有的氨基酸序列( HAIYPH) 不变的基础上,增加了一个半胱氨酸,为T7 ( CHAIYPH) 引入了巯基,以便其与脂材DSPE-PEG 连接。

作为最基本的理化性质参数,相对分子质量是有机化合物鉴定的典型指标,相对分子质量一致与否往往可用于判断所测化合物结构的正确性。MALDI-TOF-MS 是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱,不产生或产生较少的碎片离子,适用于混合物及生物大分子的测定。该法具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点。本研究以α-cyano-hydroxycinnaminic acid ( CHCA) 25-dihydroxybenzoicacid( DHA) 为基质,对T7-PEG2000-DSPE 进行MOLDI-TOF 质谱分析,方法简便可靠。此外,本研究还采用1H NM T7-PEG2000-DSPE 进行结构表征,以氘代二甲基亚砜[( CD3)2SO]为溶剂,4-甲基硅烷( TMS,δ =0 ppm) 进行标定,进一步确认了反应物为T7-PEG2000-DSPE

目前国内外已有多种建立体外BBB 模型的方法,本研究采用脑血管内皮细胞单层方法建立模型,并用与内皮细胞联系紧密的TEE 值来评价体外BBB 的建立效果。实际操作过程中由于细胞插入器内外槽中加入的培养液体积有限,会在一定程度上造成电阻仪测定结果的波动。因此可以通过观察细胞插入器内外槽液面差保持4 h 以上不变的方法,同时验证该模型建立的效果。

在以往的纳米载体处方优化研究中,一般以粒径、包封率等作为处方优劣的指标,而忽视了主动靶向载体真正的“使命”。由于细胞表面的受体数量是有限的,所以配体与受体的结合往往容易达到饱和,限制了配体介导载体进入细胞的量。在本研究的处方优化中,当T7-PEG2000-DSPE 的用量从0 增加4%时,跨越体外BBB 进入C6 细胞中的T7-NLC 在逐步增加,表明T7-NLC 的双重靶向能力在逐步增加。当T7-PEG2000-DSPE 的用量增加到6%时,进入C6 细胞中的T7-NLC 的量与T7-PEG2000-DSPE 的用量为4%时相比没有显著差异。即使T7-PEG2000-DSPE 的用量增加到8%时,进入C6 细胞中的T7-NLC 的量也没有显著增加。这表明T7 Tf 的结合达到饱和,一味地增加T7-PEG2000-DSPE 的用量并不能提高T7-NLC的双重靶向能力。本研究确定T7-PEG2000-DSPE 的用量为4%,按照该处方制备的siNA/T7-NLC 粒径和包封率都达到了较满意的要求,并具有良好的稳定性。

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