抗菌肽产生菌侧孢短芽孢杆菌高产菌选育

2020-04-01

侧孢短芽孢杆菌是既能抗菌、杀虫又有医用价值的微生物资源,具有多种生物学活性及广谱抗菌活性,尤其是对细菌和真菌。国外文献报道较多的抗菌物质有肽类抗生素、非肽类的芽孢菌胺、几丁质酶以及聚酮化合物等。其中抗菌肽是一类具有高效、广谱抗菌活性的小分子碱性多肽,耐热性、pH 值稳定性、储藏稳定性好,具有无毒副作用、无残留、无耐药性等特点。同时,抗菌肽对畜禽具有促生长、保健和治疗疾病的功能,在作为无公害饲料添加剂、药物等方面具有巨大的潜在应用前景。

等离子体诱变技术是通过对细胞有影响的荷电粒子、光、中性粒子等离子体对生物遗传物质及表层造成损伤,引起细胞自我修复,从而导致生物体基因的改变。等离子体诱变技术可以较大程度地提高诱变效率,提高细胞存活率,是一种适合于微生物诱变育种的技术。

由于实验室保存的侧孢短芽孢杆菌产抗菌肽菌株发酵单位偏低,为提高产抗菌肽菌株的产量,作者采用对数生长期的菌体作为诱变对象,利用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术筛选抗菌肽高产菌株,以降低生产成本,为工业化生产奠定基础。

1 实验

1.1 菌株、培养基与仪器

侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)KT-06,本实验室保存。

斜面及固体培养基(LB):胰蛋白胨1%,酵母粉0.5%,NaCl 1%,琼脂1.5%~2.0%,pH 值调至7.2~7.4,121℃下灭菌20min。

种子培养基:胰蛋白胨1%,酵母粉0.5%,NaCl 1%,pH 值调至7.2~7.4,121℃下灭菌20min。

发酵培养基:葡萄糖2%,玉米浆0.5%,酵母粉0.5%,CaCl20.15%,ZnCl20.005%,pH 值调至7.2~7.4,121℃下灭菌30min。

营养琼脂培养基:胰蛋白胨0.6%,牛肉浸膏0.15%,酵母浸出粉0.6%,葡萄糖0.1%,KHPO0.2%,KHPO0.8%,琼脂1.5%~2.0%,pH 值调至6.0,121℃下灭菌20min。

ARTP-ⅡS型诱变育种仪,无锡源清天木生物科技有限公司;LC-2030C型高效液相色谱仪,岛津。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备

将侧孢短芽孢杆菌KT-06斜面菌种挖块(0.5cm×1.0cm)接种于种子培养基(40mL/250mL三角瓶)中,37 ℃、200r·min-1振荡培养6~10h;取2mL加入6mL无菌生理盐水中,菌悬液浓度达到107CFU·mL-1

1.2.2 ARTP诱变

取10μL菌悬液滴加在无菌不锈钢载片上,将载片置于诱变育种仪中,按设计时间进行照射;然后将载片投入装有1.5mL无菌生理盐水的EP管中,振荡洗涤,混匀,稀释菌悬液后分离涂布到LB培养基平板上,37℃暗培养3d,计数。

1.2.3 摇瓶培养

挖块(0.5cm×1.0cm)斜面培养成熟菌种,接种于种子培养基(40mL/250mL三角瓶)中,37℃、200r·min-1振荡培养12~16h,以5%的接种量接种到发酵培养基(40mL/250mL三角瓶)中,37℃、200r·min-1振荡培养25~30h。

1.2.4 发酵液抑菌活性的测定

抗菌肽抑菌活性的测定采用琼脂扩散法。以藤黄八叠菌CMCC 28001为指示菌,用无菌生理盐水将其稀释到107 CFU·mL-1。将100mL营养琼脂培养基倒入直径195mm 平皿中,冷却凝固;取0.2mL指示菌菌悬液置于100mL冷却至50~60℃的营养琼脂培养基中,混匀倒板,冷却凝固。适当位置放置牛津杯,向牛津杯中加入300μL离心发酵液,置于37℃培养箱中培养16h,用游标卡尺测量透明圈直径(mm)。

1.2.5 发酵液HPLC分析条件

取发酵液2mL,100℃ 水浴20min,13 000r·min-1离心12min,取上清液,进行HPLC分析。

HPLC条件:C18柱(4.0mm×250mm,5μm);A相1‰三氟乙酸,B相纯乙腈,梯度洗脱(条件见表1);检测波长200nm,进样温度35℃,进样量15μL,进样流速1mL·min-1;tR7.28min,tC15min。

2 结果与讨论

2.1 ARTP诱变剂量(处理时间)的选择

在LB培养基平板上涂布经ARTP诱变处理不同时间的菌悬液,37℃培养3d,以未诱变处理的菌悬液作为对照,计算致死率;摇瓶筛选ARTP诱变处理不同时间的菌落,计算突变率,结果见表2。

由表2可知,随着ARTP诱变处理时间的延长,致死率逐渐升高;ARTP诱变处理90s时,正突变率最高。因此,确定最佳ARTP诱变处理时间为90s。

2.2 突变株摇瓶筛选

采用最佳诱变剂量对菌悬液进行ARTP诱变。第一轮ARTP诱变处理,摇瓶初筛菌株共计212株,获得36株发酵单位提高20%以上菌株;复筛3批后,获得高产菌株KT-3-15,比KT-06产量提高25.5%。进一步对菌株KT-3-15进行ARTP诱变处理,摇瓶初筛菌株共计236株,获得43株发酵单位提高20%以上菌株;复筛3批后,获得高产菌株KT-4-128,比KT-3-15产量提高33.5%,比出发菌株KT-06产量提高67.5%。

2.3 菌种选育系谱图

2.4 高产菌传代稳定性实验

菌种传代稳定性是决定菌种能否工业化生产的关键。采用斜面传代、摇瓶验证的方法,考察新菌株的传代稳定性。连续传代4次,摇瓶验证结果见表3。

3可知,连续传代4次,相对发酵转化率稳定,表明新菌株遗传特征稳定,适合工业化生产。

3 结论

以抗菌肽产生菌侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)KT-06为出发菌株,进行两轮ARTP诱变处理,获得一株具有稳定遗传性的高产菌株KT-4-128,该菌株发酵水平比出发菌株提高了67.5%。表明ARTP技术可有效应用于侧孢短芽孢杆菌的诱变选育,可大幅提高抗菌肽的发酵单位,为其工业化生产奠定了基础。

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