皮状丝孢酵母纤维素油脂发酵及抑制物耐受机制研究

作者
王娟;
摘要
利用可再生的生物质资源发酵微生物油脂是解决生物柴油的油脂原料的重要途径。皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)作为一种典型的油脂微生物,不但能够利用多种木质纤维素来源的单糖进行高效油脂发酵,而且对木质纤维素来源发酵抑制物具有良好的耐受性,适合于利用木质纤维素原料以生物炼制方式进行微生物油脂的发酵生产。本文中首先对T. cutaneum ACCC 20271利用木质纤维素原料通过干法生物炼制方法生产微生物油脂和合成生物柴油的最大潜能进行了实验研究,分析了该菌株对木质纤维素来源抑制物的耐受能力及降解特性。其次,通过全基因组测序,对其高油脂积累、高抑制物耐受性的分子生物学机制进行了预测,推测了其中心碳代谢、油脂合成及抑制物降解等完整的代谢路径。最后,尝试了以微生物油脂发酵的方式,在利用废水中残糖和其它有机物为底物获得微生物油脂的同时,降低纤维素乙醇发酵废水中的化学需氧量(COD)浓度。此外,还对T. cutaneum ACCC 20271中菊粉水解酶的特性进行了分析,探究了T. cutaneum菌株对菊糖水解和油脂发酵的整合加工发酵微生物油脂的能力。木质纤维素生物质预处理过程中生成的抑制物对后续的纤维素酶活性,以及油脂微生物的活性和代谢都会产生严重的抑制,导致后续的生物转化无法正常进行。因此,寻找具有高抑制物耐受性的油脂微生物是纤维素油脂生产的首要问题。本文首先以实验手段对T. cutaneum ACCC 20271利用木质纤维素原料经过干法生物炼制加工后的油脂发酵最大潜能进行了评价。玉米秸秆原料经过干法稀酸预处理和生物脱毒后,在不同秸秆固体含量的条件下进行纤维素酶水解以获得富含葡萄糖、木糖等可发酵单糖的玉米秸秆水解液。T. cutaneum ACCC 20271在玉米秸秆水解液中表现出了优良的生长、油脂累积等性能。以干法生物炼制技术获得的玉米秸秆水解液为原料,菌体干重及油脂产量分别达到31.31 g/L和8.57 g/L。微生物对抑制物的耐受性主要是体现在其对抑制物的降解性能。本文首次分析、推测了7. cutaneum ACCC 20271对木质纤维素来源抑制物的耐受能力、降解能力和降解机制。木质纤维素预处理过程中产生的抑制物主要包括有机弱酸、呋喃醛和酚醛三种类型。本文选取甲酸、乙酸、乙酰丙酸作为有机弱酸的代表性抑制物,糠醛、羟甲基糠醛作为呋喃醛的代表性抑制物,以香草醛、丁香醛、4-对羟基苯甲醛作为酚醛的代表性抑制物。这些抑制物对各类油脂微生物具有明显的抑制作用,限制其生长及后续的发酵生产。研究发现T. cutaneum ACCC 20271可耐受6g/L甲酸、25g/L乙酸、10g/L乙酰丙酸、5g/L2 g/L香草醛、2.5g/L丁香醛;该菌株对糠醛最为敏感,低含量的糠醛(0.5g/L)即可显著抑制其生长;4-羟基苯甲醛次之(25 g/L)。T. cutaneum ACCC 20271可以完全将有机弱酸中的甲酸、乙酸完全转化,并将糠醛、HMF,以及丁香醛、香草醛、4-羟基苯甲醛通过先还原为相应的醇,再通过氧化反应生成低浓度醛和酸的方式将高毒性的抑制物转化为低毒性的酸,其中而4-羟基苯甲醛和香草醛可以实现完全转化进入中心碳代谢,而糠醛、HMF、丁香醛只能以其相应的醇和酸的形式存在而不能实现终极降解。通过长期适应性培养得到驯化菌株T. cutaneum 277,该驯化菌株于15%未脱毒玉米秸秆水解液中的油脂产量为5.17g/L,而原始菌株仅为0.15g/L在对抑制物降解实验基础上,本文采用Illumina-Miseq测序平台对T. cutaneum ACCC 20271进行全基因组测序和相应的基因注释,并根据全基因组测序数据对T.cutaneum ACCC 20271的高油脂积累和高抑制物耐受性的机制进行了分析。T. cutaneum ACCC 20271的基因组全长30.45 Mb,预测到5704个蛋白编码基因,925个非编码RNA基因。依据基因组注释对T. cutaneum ACCC 20271的中心碳代谢、油脂合成路径进行了推测。该菌株中含有完整的糖酵解、三羧酸循环(TCA)、戊糖磷酸途径(PPP)、脂肪酸合成路径、磷脂及甘油三酯合成、脂肪酸β-氧化、乙醛酸循环等代谢路径。根据实验结果、基因组注释及已有的相关研究报道,首次完成了T. cutaneum ACCC 20271的木质纤维素来源抑制物生物转化和脱毒的代谢路径推测。对呋喃醛、酚醛代谢路径上的功能基因进行了收集和整理,并与圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides NP11)、耶氏酵母(Yarrowia lipolytica CLIB122)、油脂丝孢酵母(Trichosporon oleaginosus IBC0246)三株油脂酵母进行了比对分析。T. cutaneum ACCC 20271中的醇脱氢酶、醛还原酶、醛脱氢酶、氧化酶编码基因共计101个,这可能是其对抑制物高耐受性的重要生物学基础。最后,对利用油脂酵母发酵的方式以降低纤维素乙醇发酵废水的化学需氧量(COD)的方法进行了实验分析和可行性评估。纤维素乙醇发酵醪精馏后得到的塔底出料,再经过固液分离后的废水中含有大量可以被油脂酵母利用的单糖和有机组分,COD值高达112.41 g/L。本文以T. cutaneum ACCC 20271为发酵菌株在纤维素乙醇发酵废水中进行油脂发酵,培养120 h后废水中的COD值降低至53.31 g/L,同时菌体干重及油脂产量分别达到16.20、2.16 g/L。脂肪酸组分分析结果表明,T. cutaneum ACCC 20271利用纤维素乙醇发酵废水累积得到的油脂与植物油相似,可作为生物柴油生产的原料。这一方法在获得微生物油脂的同时,COD值降低了55.05%,部分实现了以油脂发酵方式进行纤维素乙醇发酵废水处理以降低COD的目标。此外,本文对以菊粉为原料的T. cutaneum由脂发酵进行了旨在实现酶水解和油脂发酵整合生物加工方式的过程研究。发现T.cutaneum ACCC 20271可以直接利用菊粉进行生长及油脂累积,证明了细胞中菊粉水解酶的存在。分析了T. cutaneum ACCC 20271中菊粉水解酶的最适pH及最适温度等酶学特性,结果表明在30-70℃范围内,随温度升高该酶的稳定性降低,而在pH 3.5-6.5的范围内其稳定性没有显著变化。结合基因组注释等信息,推测T.cutaneum ACCC 20271中菊粉水解酶为β-果糖苷酶。通过上述研究,发现T.cutaneum ACCC 20271可将木质纤维素来源抑制物完全降解或转化为低毒的醇、酸,具有高效利用木质纤维素来源单糖发酵油脂的能力;首次推测出T. cutaneum ACCC 20271酵母中典型抑制物的生物转化与脱毒的代谢路径;利用T.cutaneum ACCC 20271可显著降低纤维素乙醇发酵废水的COD浓度,并可累积一定量可作为生物柴油原料的油脂;菊粉水解酶的存在是T. cutaneum ACCC 20271整合生物加工菊粉生产微生物油脂的重要生物学基础。这些研究结果将为皮状丝孢酵母生产微生物油脂的深入研究、基因工程改造、产业化生产等奠定理论基础。
关键词/主题词
皮状丝孢酵母(Trichosporn cutaneun ACCC 20271);微生物油脂;木质纤维素;抑制物;代谢路径;纤维素乙醇发酵废水;整合生物加工
页数
147
出版日期
2016-09-29
学位授予单位
华东理工大学
学位年度
2016
学位
博士
导师
张惠展;鲍杰
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