中草药中农药残留检测技术新进展

北京市农林科学院 2011-06-17

中草药是我国医药宝库的重要组成部分,是几千年来我国人民防治疾病的重要武器.此外,由于其显著的疗效、预防保健作用以及天然性,愈来愈受到世界各国人们的青睐,使用量和出口量日益增加.但中草药有效成分的复杂性和不确定性、以及农药、重金属含量超标,已成为制约中药国际化的瓶颈.随着我国加入WTO以及中药现代化项目的不断实施,中草药农药残留问题得到普遍关注,相关的研究也日益增多.农药的种类众多,中国常用农药主要为有机氯类、有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类等.有机氯类农药包括六六六,DDT等,我国已在1983年禁用该类农药,但由于其半衰期长,至今仍在土壤、地下水等环境中有残存,它们容易在人体内蓄积造成慢性中毒,严重危害人类健康].有机磷类和氨基甲酸酯类会抑制生物体内胆碱酯酶的活性,导致传导介质代谢紊乱,产生迟发性神经毒性,不过它们降解快,在中草药中检出率较低,残留量也低.拟除虫菊酯类农药则会影响细胞色素c和电子传递系统,引起肌肉震颤与抽搐.中草药中农药残留具有普遍性,几乎所有样品都有检出,种植药材残留量较高,而野生药材仅有痕量检出,它们不易发生急性中毒事件,但慢性中毒不容忽视.本研究主要对中草药中残留农药的提取与纯化及其测定方法进行综述.

1 中草药中农药残留的前处理

农药残留的前处理包括提取和纯化,目的是将样品中痕量农药从其他干扰物质中分离提取并进行富集,除去干扰物质.

1.1 中草药中农药残留的提取方法农药残留提取首先应根据农药的性质,选择合适的溶剂和提取方法.采用相似相溶原理来选择溶剂,既可采用单一溶剂,也可采用混合溶剂.常用的提取方法有漂洗法、振荡法、组织捣碎法、冷浸法、索氏提取法、超声法、固相萃取法和超临界萃取法等.目前最常用的是振荡法超声法.

1.1.1 索氏提取法(Soxhlet Extraction,SHE) 采用连续回流装置索氏提取器,将适量的中药粉装入滤纸筒,选择合适的溶剂,水浴加热回流提取.阎正等用石油醚一丙酮混合物在索氏提取器中回流10—12 h对怀牛夕等5种中草药中有机氯类农药多残留进行提取分析,加样平均回收率为88.8% 一99.1%.索氏提取法虽提取效率较高,但受热时间长,对热不稳定的化合物不宜采用.

1.1.2 振荡法(Oscillation Method) 通过振荡来提高溶剂的湍动程度,从而提高提取速度与效率.徐小琴等 用正己烷一丙酮(8:2)振荡提取,Flofisil硅土色谱柱净化,GC—MS联用测太子参药材中有机氯类农药残留,平均加样回收率为70.7% 一124% ,相对标准偏差(Rso)为0.9% 一11%.

1.1.3 超声法(Ultrasonic—Assisted Extraction,UAE) 通过一定品质的超声波使被“束缚”在中药材生物细胞中的残留农药解离出来,数十秒或数分钟即可完成提取,从而强化提取的速度和效率.万益群H 等以丙酮一石油醚混合溶剂为提取剂超声提取,固相吸附法净化,气相色谱一火焰光度检测器(GC—FPD),检测中药中多种有机磷农药残留量,回收率大于85.5%.黄卫平等 在测定与分析浙八味药材中9种有机氯农药残留量时,以混合溶剂超声提取样品、浓硫酸磺化净化、GC法检测,结果延胡索、麦冬和杭白菊均检出DDT,含量分别为0.439 q45.017、5.434 ng·g~;杭白菊检出五氯硝基苯,含量为1.030 ng·g~;其余药材均未检出有机氯农药残留.

1.1.4 微波辅助提取法(Microwave—Assisted Extraction,MAE) 有机物受微波辐射,进行有序到无序的反复运动使样品迅速加热.微波渗透力强,可深入分子内部,使样品受热均匀.内部分子运动使溶剂与分析物受热均匀,加速提取.冯秀琼等采用微波辅助提取法测定金银花、三七、枸杞中14种有机磷农药残留,经C。。一硅胶固相萃取(SPE)柱净化,气相色谱测定,标准添加回收率为8O.5% 一102.7% ,RSD为1.2% 一8.1% ,最低检出浓度为0.0O4 mg·kg (敌敌畏),0.026 mg·kg (丙溴磷).

1.1.5 吹扫蒸馏(Sweeping Distillation) 吹扫蒸馏实际上是一种动态顶空技术.在较高温度下,利用惰性气体(如N:)进行吹扫蒸馏,使农药或其他有机物质先挥发,动物油脂或植物提取物保留在分馏管的玻璃珠上,从而达到分离、纯化的目的.挥发的农药可被收集管的Florisil硅土吸附,首先用溶剂洗脱下来,再浓缩,测定.

1.2 中草药中农药残留的净化方法纯化方法通常有液一液萃取法、固相萃取法、凝胶渗透色谱法、薄层色谱法、低温冷冻法、氢氧化钾净化法、化学方法(如磺化法)等,后几种方法因为应用条件较单一或限制较多而较少采用.如磺化法适于耐硫酸处理的有机氯类农药等进行样品检测前的纯化预处理.

1.2.1 液一液萃取法(Liquid—Liquid Extraction,LLE) 这是最早使用的一种提取净化方法.利用待测农药与干扰杂质在两种互不相溶的溶剂中溶解度(分配系数)的差异而达到分离的目的.方法简单、经济、易于操作,但耗费溶剂较多,而且易乳化.王会丽等川在对黄芪、甘草中有机氯农药残留量进行气相色谱检测中,将样品先以丙酮提取,在氯化钠存在下以二氯甲烷进行液一液萃取再以硫酸净化,加样回收率在77.8% 一102.5%.万益群等 用含30%丙酮的乙腈对样品提取,正己烷进行液一液分配,提取液用弗罗里硅土柱净化,毛细管柱分离,气相色谱法一电子捕获检测器(GC—ECD)同时检测,建立了中草药中11种有机氯农药和8种拟除虫菊酯农药的残留分析方法.在两个水平添加时的回收率(n:5)分别为78.6% 一119.7% 和86.5% 一114.0% ,RSD分别为3.6% 一8.7% 和4.4% 一10.2%.检出限为:有机氯农药0.005 mg·kg~,拟除虫菊酯农药0.01 mg·kg~ .

1.2.2 固相萃取法(Solid Phase Extraction,SPE) 固相萃取技术克服了液一液萃取及普通柱层析技术的缺点,与液一液萃取相比可以节省约90%的提取时间和溶剂,减少杂质引入,避免乳化现象产生.固相萃取根据柱填料可分为吸附型(如硅胶、大孔吸附树脂等),分配型(C¨C 苯基柱等)和离子交换型3种类型.根据待测农药性质、种类等选用合适的萃取柱和洗脱剂可使萃取、富集、纯化一步完成,方法快速,重现性好,并且容易实现自动化.吸附柱色谱法是固相萃取中最常用的一种,利用农药残留和杂质对固定相表面吸附中心吸附能力的差别而进行分离.常用的吸附剂有硅胶、氧化铝(酸性、中性、碱性)、弗罗里硅土(Florisil)、活性炭、硅藻土等.郭青等采用弗罗里硅土固相萃取净化样品,Gc—ECD测定5种中药材中26种有机氯和拟除虫菊酯类农药残留量,平均回收率(n=9)为69.6l% 一112.80% ,RSD为2.43% 一16.51%.吴永江等将中药材样品以丙酮提取,弗罗里硅土净化处理,GC—MS检测中药材中16种残留农药,效果较好,回收率为70.5%一105.O%.t

1.2.3 凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography,GPC) 又称为尺寸排阻色谱(Size Exclusion Chromatography,SEC).它是基于体积排阻的分离机理,通过具有分子筛性质的固定相,用来分离相对分子质量较小的物质,并且还可以分析分子体积不同、具有相同化学性质的高分子同系物 “.夏品华等 建立了凝胶渗透色谱净化一毛细管气相色谱测定中成药中有机氯农药残留量的方法,采用凝胶渗透色谱替代硫酸净化,有效地克服了硫酸净化回收率偏低的难题.低、中、高3个添加水平的回收率分别为85.5%一115.0% 、84.3% 一123.4%、86.7% 一114.O% ,RSD为0.1% 一9.3%.陆继伟等H 将灵芝样品经冰浴超声提取,凝胶渗透色谱净化,采用GC—FPD法测定灵芝中24中有机磷农药残留量,平均回收率在75.28% 一117.18% ,RSD为3.19% 一l5.57% .

1.3 农药残留前处理新技术

1.3.1 固相微萃取技术(Solid—Phase Micro—Extraction,SPME) 这是一种在固相萃取的基础上发展起来的新方法.固相微萃取的机制是吸附和热解吸,取样、提取、浓缩、进样等全过程无需溶剂,具有简单、高效、快捷的特点.进样不用溶剂,改善了色谱分离效率,纤维可重复使用,十分经济.常用的固定相为聚二甲基硅氧烷,用于提取非极性有机物;聚丙烯酸酯,用于提取极性有机物.Hwang等” 对中草药中的l9种有机氯杀虫剂残留进行了分析,并用含18种有机氯杀虫剂的混合标样作外标、以五氯硝基苯作内标进行定量分析.线性范围平均为1-200 mg/kg,检测限低于1 mg/kg.张廉奉等¨ 采用三苄基杯 芳烃/羟基硅油(C[6]/OH—TSO)探头SPME与GC联用测定中草药中8种有机氯农药的残留量.经验证在萃取温度70℃ ,时间

为30 rain,加入NaG1 2.0 g时萃取效果最佳,加样回收率为88.56% 一103.2% ,RSD在6.23% 一9.85%.

1.3.2 超临界流体萃取技术(Supercritieal Fluid Extraction,SFE) 超临界流体技术是利用临界温度以上的高密度气体,既具有气体粘度小、扩散速度快、渗透能力强的特点,又具有液体对样品溶解性能好,可在较高温度下操作的特点.应用超临界流体可以对被分析样品进行连续提取,并可通过调节温度、压力、添加适当极性调节剂来选择提取某种目标分析物.一般常用的超临界流体是超临界CO ,它无毒、极性小,可用于提取极性或弱极性的残留农药.超临界流体萃取温度低,尤其适合热敏性化合物,并且超临界流体萃取可与气相色谱、高效液相色谱、超临界流体色谱联机.李欢欣卅等采用超临界CO:流体萃取法,提取黄芪中残留的有机氯农药,用毛细管气相色谱法测定除毒前后黄芪中农药残留量,残留农药去除率达87.6% ,RSD=2.6%.

1.3.3 基质固相分散技术(Matrix Solid—Phase Dispersion,MSPD) 基质固相分散技术是将样品与吸附剂(硅胶、弗罗里硅土、C C 等)充分研磨,装入层析柱,选择合适的溶剂洗脱,适当浓缩后测定.可使样品的提取、浓缩、净化一次完成.适用于多残留分析,特别适合于同类化合物或单个化合物的分离.冯秀琼等分别采用干法或湿法将金银花、三七和枸杞等药材与Florisil硅土充分研磨,装入含有少量混合吸附剂的层析柱,用乙酸乙酯或(和)丙酮洗脱,洗脱液减压浓缩,然后用毛细管柱气相色谱法,同时测定了样品中l4种有机磷农药,回收率>80% ,最低检测浓度为0.004—0.026 mg·kg~.

1.3.4 加速溶剂萃取(Accelerated Solvent Extraction,ASE) 它是在较高的温度和压力下,用有机溶剂萃取固体或半固体样品,是一种较新颖的样品前处理方法.该法已被美国EPA(环保局)选定为用于环境样品中杀虫剂、除草剂以及多氯联苯、二嗯英等污染物检测时,被推荐使用的标准方法(标准方法编号3545)n引.吴胜芳¨ 等用加速溶剂萃取、GC—MS测定菊花中3种菊酯类农药残留,回收率80% 一106% ,RSD为5% 一13%.

1.3.5 免疫亲和色谱(Immune Afinity Chromatography,IAC) 是利用抗原与抗体的高亲和力、专一性和可逆结合的特性,基于色谱的差速迁移理论而建立的一种色谱方法.把抗体固定在适当的支持物上,制成免疫亲合色谱的固定相,当含有目标物的样本粗提液经过免疫亲合色谱柱时,粗提液中对抗体有亲合力的目标物就被结合到抗体上.在淋洗去掉非目标分析物后,采用适当条件将结合在抗体上的目标物洗脱下来,从而使被测物选择性地被提取与浓缩.所得提取物可直接采用气相色谱、高效液相色谱、酶联免疫吸附等方法进行检测.曲虹云等 用免疫亲和色谱柱净化和富集2,4一D、莠去津,并进行了测定.目前该技术在国内尚处于研究阶段.

1.3.6 分子印迹技术(Molecular Imprinting Technology,MIT) 以目标分子为模板分子,将具有结构上互补的功能化聚合物单体,通过共价或非共价键与模板分子结合,并加人交联剂进行聚合反应.反应完成后,将模板分子洗脱出来,形成的一种具有固定空穴大小和形状,并有确定排列功能团的交联高聚物,这种交联高聚物即分子印迹聚合物(MIP).Tamayo F.G.等23以苯脲杀虫剂非草隆为模板分子,用沉淀聚合法制备了键合位点分布均匀的MIP微球,填充SPE柱 可选择性地吸附小麦、大麦、土豆及胡萝卜的乙腈提取液中的非草隆(100 ng·g ),对非草隆结构类似的其他苯脲杀虫剂无交叉吸附.采用HPLC检测,回收率为98% 一115%.

2 中草药中农药残留的分析测定方法

农药的残留性是指随着农药的使用,其中的物质及其转化产物残留于农作物和土壤中的情况.当检测药材中农药残留量时,不仅要考虑农药的相关成分,而且要考虑农药成分在植物体内经转化生成的所有相关物质.对于农药残留不明的中药样品,一般可采用测定总有机氯量和总有机磷量的方法;使用过已知农药的样品,农药残留量测定主要依赖于色谱法.前者简便易行,适于基层;后者灵敏度高,专属性强.

2.1 薄层色谱法( n Layer Chromatography。TLC) 中药样品经适当处理后,点样于薄层板上,展开,依据比移(Rr)值定性分析;也可在薄层扫描仪上进行定量检测.薄层色谱法操作简便、分析速度快,但灵敏度低,近年来使用较少,一般用于现场筛查.

2.2 气相色谱法(Gas Chromatography,GC) 由于气相色谱法具有高选择性、高分离效能、高灵敏度、快速等优点,因而是农药残留量检测最常用方法之一].适用于相对分子质量较小、易气化并且气化后不发生分解的农药的残留量分析.气相色谱法测定有机氯农药时,使用电子捕获检测器(ECD);测定有机磷农药时,使用火焰光度检测器(FPD).王陆玲 等以人参和桔梗为研究对象,利用GC—ECD同时测定样品中有机氯和拟除虫菊酯类农药残留的含量,其回收率在70% 一110% ,11种农药在0.01—0.25 mg·L一浓度范围内线性关系较好,相关系数大于0.995,仪器最低检测限为10 一10 g.向增旭等 建立

了GC法一次性测定金银花中18种有机磷农药残留量的方法,采用脉冲式硫磷检测器(PFPD),HP一1701毛细管柱的气相色谱仪检测,结果18种农药在30 min内完全分离,检测限为4.0—18.0 g·ks~,对18种有机磷农药在金银花中的添加回收率83.64% 一88.65% ,RSD为2.8% 一6.O%.谢明勇等建立了江西中草药鸡血藤、车前子中多种有机磷农药残留量同时检测的方法,以GC—FPD为检测手段,检测限浓度为0.Ol1—0.017 mg·L~,方法回收率为84.5% 一108.9%.

2.3 高效液相色谱(HigIl Performance Liquid Chromatography。HPLC) HPLC是在经典液相色谱法的基础上,以高压输送流动相,采用高效固定相及高灵敏检测器,发展而成的现代液相色谱分析方法.它具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高、操作可自动化等特点.与气相色谱相比,还有以下优点:不受试样挥发性和热稳定性限制,应用范围广;分离选择性高;一般在室温下分离,不需要高柱温.彭方等采用RP—HPLC法,DiamonsilC。。色谱柱,流动相为甲醇一四氢呋喃一水(43:2:55),测定人参中多菌灵农药残留量,人参茎叶平均回收率为83.94% ,RSD为2.42%(n=6);人参根平均回收率为87.38% ,RSD为2.68%(n:6).多菌灵在1.926—192.6 ng时,相关系数r=1.000 0,呈良好的线性关系.陈美艳等采用高效液相色谱法,研究20%吡虫啉在枸杞金银花口 中的消解动态,吡虫啉在枸杞中的半衰期为1.63 d,施药10 d后残留量降至0.012 6 nag·ks~;在金银花中的半衰期为1.58 d,施药10 d后残留量由4.302 5 mg·kg 降至0.048 2 mg·kg~.吡虫啉在两种草药中的最终残留量在0.002 mg·kg 以下.样品的添加回收率分别为87.6% 一96.0% 、87.53% 一98.50% ,RSD分别为1.5% 一3.1% 、1.8% 一2.7% .

2.4 色谱一质谱联用

2.4.1 气相色谱一质谱联用(Gas Chromatography~Mass,Gc—MS) 该方法既具有气相色谱的高分离效能,又具有质谱准确鉴定化合物结构的特点,可达到同时定性、定量检测的目的.GC—MS分析灵敏度高,适合低分子化合物的分析,尤其适合挥发性和半挥发性成分的分析,主要包括有机氯类(OCs)、有机磷类(OPs)、有机氮类(多为三嗪)、氨基甲酸酯类等化合物.万益群等 采用GC—MS同时测定中草药中多种有机磷及氨基甲酸酯类农药残留量,农药混标在0.O1—1.0 mg·L 范围内线性良好,在0.5、0.1、0.05 mg·L 3个水平添加平均回收率分别为86.5% 一110.6%、81.2% 一108.3%和72.9% 一122.3% ,RSD分别为2.6% 一8.3% 、4.6% 一9.7%和2.3% 一10.7%.Zhu He等 建立了大量样品同时测定拟除虫菊酯类农药多残留的方法,应用GC—MS法,以负化学电离(NCI)模式检测6种中草药中5种拟除虫菊酯类农药残留,检测限为0.5—5 g·L~,回收率为70% 一120% ,RSD低于10%.聂春林等 建立了一种同时测定中草药中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯等4大类40种农药残留量的分析方法,用∞ 一MS选择离子模式进行测定,以外标法定量,回收率在88.6%和107.1%之间,RSD均低于8.0% ,各农药检测限为0.5—37.5 ·kg~,定量限为1.4—112.5 g·ks~.

2.4.2 液相色谱一质谱联用(Liquid Chromatography—Mass,LC—MS) 工作原理与气一质联用相似,即以高效液相色谱为分离手段,以质谱为鉴定手段,通过适当接口将二者连接成完整仪器.HPLC—MS具有以下突出特点:适用范围宽,测定相对分子质量可达4 000—6 000;不受试样挥发性限制;可用于强极性化合物;可以提供各种信息;有很高的灵敏度和样品通量.吴永江等应用液一质联用的方法对铁皮石斛和西洋参及制剂中的多菌灵残留进行分析,平均回收率在95.6%以上.

2.5 毛细管电泳法(Capillary Electrophoresis。cE) 毛细管电泳(CE)中较常用的两种模式是:毛细管区带电泳(CZE)和胶束电动毛细管色谱(MEKC).CZE特别适合分离常规液相色谱难以分离的离子性化合物,具有分离效率高、速度快、操作简便等特点.MEKC是以胶束为假固定相的一种电动色谱,可以分离CZE中无法分离的中性化合物.虽然毛细管电泳在分离科学中已有广泛应用,但因其检测灵敏度不高,在痕量分析中的应用受到一定限制.赵燕燕等利用胶束毛细管电泳在线吹扫富集技术检测麻黄中的农药残留,弥补了毛细管电泳灵敏度低的缺点.预处理简便,为中药中残留的痕量农药检测提供了一种新的、简便可靠的方法.赵燕燕等还对胶束毛细管电泳在线吹扫富集技术(MEKC on—line Sweeping)和毛细管气相色谱法(CGC)两种农药残留测定方法进行了比较,结果在精密度、回收率、样品测定上无显著差异.采用MEKC on—line Sweeping处理样品时,方法简单、检测范围广.而采用CGC法时,虽然检测限较低,但不能直接用于低挥发性农药如吡虫啉的测定.

2.6 免疫分析法(Immune Analysis。IA) 免疫分析是基于抗原抗体特异性识别和结合反应为基础的分析方法.20世纪8O年代初,Hammock等首先将免疫分析应用于农药残留分析以来,该法得到不断改进和发展,并涌现出诸多各具特色的免疫分析方法,用于检测不同的农药.在农药分析中应用较多的是酶联免疫吸附法(ELISA).该技术用化学方法使酶与抗体或抗原结合,生成标记物,或通过免疫方法将酶与抗酶抗体结合,生成酶抗体结合物.在合适的载体上,使酶标记物或酶抗体结合物与相应的抗体或抗原反应,生成酶标记的结合物.结合在酶标记结合物上的酶可以催化相应的底物,生成有色物质,以比色法确定农药残留的含量.该方法专一性强、灵敏度高,无需复杂的检测设备,快速简便,检测水平可达ng或pg水平.但是抗体制备难度较大,由于抗体有特异性,只适用于单一农药残留量的检测分析.而且农药本身不具有免疫原性,必须与载体蛋白质连接形成农药一载体蛋白质结合物免疫原,才可用来制备抗体.刘曙照等。加建立了对克百威具高度特异性的间接竞争、包被抗原、包被抗体直接竞争酶联免疫吸附测定(ELISA)法.其对克百威测定的线性浓度范围为0—1 024 mg·L一。检测限≤0.01 mg ·L一.

2.7 生物传感器(Biosens0r) 生物传感器通常是指由一种生物敏感部件与转换器紧密结合,对特定种类化学物质或生物活性物质具有选择性和可逆响应的分析装置 .在农药残留检测领域,主要利用农药对靶标酶(如乙酰胆碱酯酶)活性的抑制作用研究酶传感器,利用农药与特异抗体相结合的反应特性研制免疫传感器,可用于对相应农药残留进行快速定性定量检测.微型化的免疫传感器对分析样品的用量少、响应速度快,甚至可插人生物组织或细胞内实现超微量在线快速跟踪分析.但目前存在的主要问题是分析结果的稳定性差、重现性差、使用寿命短和使用成本高.Metha等 首先把乙酰胆碱酯酶共价偶联到金纳米粒子生成的生物传感器,浸入至0.05 mmol·L 乙酰胆碱(Ach)溶液中,采用局部表面等离子体共振技术,成功测定在l一100 mg·L 范围内的有机磷农药对氧磷,而且这种传感器在4℃存储60天仍保持活性,具有灵敏度高、稳定性好等优点.

3 农药残留分析的发展方向

农药残留检测技术发展到今天,已取得重大进展,特别是样品前处理技术的发展,各种先进的检测技术、检测仪器的应用,大大提高了农药残留的检测范围,检测的灵敏度.目前农药残留检测技术的主要发展方向集中在快速检测、在线监测、多类型农药的多残留分析、同类型农药的多残留分析、痕量分析等方面.很多新方法和新技术已经成功应用在食品、农作物中农药残留的检测_4 ,如农药残留试纸法、酶片法、酶联免疫试剂盒法、农药多残留扫描法等快速检测方法.而它们在中草药中农药残留分析中的应用还处于探索之中,未能发挥其快速、准确、灵敏的检测作用.因此,要及时借鉴食品、农作物、环境等领域的新技术、新方法,并使之应用到中草药的农药残留检测中.农药残留的分析已逐步走向多元化、简便化、快速化.对于我国这样一个中草药主要生产国,为提高中草药的国际竞争力,制定合理的中草药质量标准,保证用药的安全性,提高中草药中农药残留量的检测水平仍是一个重要课题.同时我们应该及时引进、吸收国际上在农药残留检测领域的最新研究成果,及时更新检测方法,提高检测水平.

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