多目标优化新型除草剂高粱素生物合成关键酶ARS的异源双控表达

2019-01-17

随着通过随机合成筛选模式开发新型除草剂的成功几率越来越小,利用植物的化感作用来防除杂草是目前杂草综合防治的研究趋势之一。高粱素(sorgoleone)是研究和应用最为广泛的化感物质之一,是由高粱(Sorghum bicolor)疏水根分泌的一种苯醌类化感物质,可对阔叶、单子叶和双子叶等多种杂草的生长表现出显著的抑制作用,目前已被用于小麦和玉米等重要大田作物的杂草控制。烷基间苯二酚(alkylresorcinols)是高粱素生物合成的重要前体物质。在生物体内,烷基间苯二酚由Ⅲ 型聚酮合酶家族中的烷基间苯二酚合酶(alkylresorcinol synthasesARS)催化合成,该反应是高粱素生物合成的关键限速步骤。此外,烷基间苯二酚还与植物生物膜稳定性和通透性、保护植物免受氧化应激损伤、产生化感物质等生理功能密切相关。

将高粱素生物合成途径中的相关酶系在大肠杆菌中进行异源表达,构建微生物体内高粱素合成的代谢途径,是实现高粱素的生物合成的前提和基础。其中,细胞破碎是提取胞内产物最难且最复杂的步骤。项目组前期构建了一种包括:1)温敏诱导启动子λ cI857/pRpL串联噬菌体裂解基因SRRz构成的温控裂解元件;2)lac启动子串联Sb_ARS 基因构成的IPTG (Isopropyl β -D -1 -thiogalactopyranoside,异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)诱导目的基因表达元件的双控表达质粒pBM123-ars,实现了Sb_ARS在大肠杆菌中的可温控自裂解异源表达。初步优化后发现目的基因的诱导表达条件与宿主菌的裂解条件并不一致。为实现高粱素大规模生产,依次通过BP设计、最陡爬坡设计、中心组合响应面设计及线性加权多目标优化对Sb_ARS的重组菌的双控诱导表达条件进行多目标优化,以期获得总体最优,为Sb_ARS的工业化生产和理论研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、试剂

重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/pBM1230-ars由本实验室构建及保存。其中,ars为高粱烷基间苯二酚合酶基因(GenBankSb08g003170)

氨苄青霉素(ampicillinAmp)IPTG购于生工生物工程(上海)股份有限公司;丙二酰-CoA、棕榈酰-CoA5-pentadecyl resorcinol标准品(alkylresorcinol standard C15:0)购于Sigma Aldrich公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 培养基

LB(Amp)培养基(g/L):蛋白胨10、酵母粉5NaCl 10Amp 0.05pH7.5

发酵培养基(g/L):甘油510、蛋白胨1015、酵母粉510NaCl 1015MgSO4·7H2O 0.51、甘氨酸0.40.8Amp 0.05pH值为7.5

1.2 试验方法

1.2.1 重组大肠杆菌的诱导表达

挑取E. coli BL21(DE3)/pBM1230-ars单菌落,接入LB(Amp)培养基,于30 200 r/min振荡培养过夜。按6%的接种量接于50 mL LB(Amp)培养基中,30 200 r/min振荡培养4 h。加入终浓度为0.8 mmol/LIPTG 30 ℃诱导Sb_ARS表达4 h,再升温至38 ℃热诱导裂解蛋白SRRz表达2 h,最后降温至30 ℃裂解培养3 h。在各优化试验中,试验条件分别见表13

1.2.2 Sb_ARS的分离及酶活测定

双控表达结束后,于4 ℃、13 000 r/min离心15 min,分离培养液。上清液透析后用蛋白超滤管浓缩,得胞外粗酶液。菌体重悬于裂解缓冲液(50 mmol/L Tris-ClpH7.25%甘油,50 mmol/L NaCl)中,在液氮和25 ℃水浴中重复冻融3次,再于冰浴中超声波破碎(振幅:300 W;超声循环:超声3 s,间隔3 s,时间4 min)。将超声破碎后的菌体再次离心(4℃,13 000 r/min15 min)后收集上清液,透析和蛋白超滤管浓缩后得胞内粗酶液。

0.3 mmol/L棕榈酰-CoA为起始底物,0.7 mmol/L丙二酰-CoA为延伸底物,加入20 μL粗酶液,缓冲液(50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4pH7.0)补足200 μL30 ℃反应60 min后,添加50 μL甲醇终止及萃取产物。于13 000 r/min离心1 min后分离上层有机相,真空干燥收集油状产物,通过HPLC法测定其中5-烷基间苯二酚含量。

酶活力单位(U)定义:每分钟催化产生1 μmol 5-烷基间苯二酚所需的酶量。

1.2.3 裂解率的测定

1.3 试验设计方法

1.3.1 Plackett- Burman试验设计

对包括培养表达条件和培养基成分在内的11个因素进行了考察。每个因素取2个水平,平行试验3次,响应值为Sb_ARS酶活力和裂解率。采用Minitab 17(Minitab Inc.)进行试验设计和数据分析,因素及试验水平见表1

1.3.2 最陡爬坡试验设计

为了更接近所选择的因子的最佳范围,最陡爬坡设计可用于快速的逼近最优化区域,其试验设计水平见表2

1.3.3 中心组合响应面设计

以最陡爬坡试验中实验4为响应面设计的中心点,采用Design Expert 10 (Stat-Ease Inc.)进行3因素5水平的中心组合响应面设计,实验设计见表3

中心组合响应面设计中,实验由8(=23)个实验点、6(=2×3)个分布在轴上的星号点,6次的零水平中心实验点,共20次实验构成。实验组合设计见表4

1.3.4 基于线性加权的多目标优化

在进行多目标优化时,权重常数(weighted coefficient,Wn)用于对二次函数进行线性加权,其定义为:

给定wW,将求解多目标优化问题式转化为求解问题y,可表达为:

本研究将Sb_ARS酶活力与裂解率的权重各设为0.5,求解最大值所对应的表达条件即为最优表达条件。

2 结果与分析

2.1 PB设计结果和分析

如表5所示,裂解率基本维持在75%85%范围内,Sb_ARS 酶活力维持在94%102%范围内(将初始双控诱导表达条件下的Sb_ARS酶活力定义为100%酶活力)。通过对Sb_ARS酶活力(YE)和裂解率(YL)与表1所列的11个因子进行多元回归拟合,建立线性模型为:

方差分析结果显示,响应量均与变量之间存在着极显著的线性关系(P<0.001),相关系数R2分别说明筛选试验中91.64%85.85%的数据可以由此模型来解释,模型实验误差在可接受的范围之内,模型对本试验的拟合度良好。

由表1的变量显著分析结果可知:转数、酵母膏浓度、蛋白胨浓度、NaCl浓度和MgSO4·7H2O浓度等5个因素对裂解率和Sb_ARS酶活力的影响均不显著(P>0.05)。与前期结果相同,菌体培养时长和IPTG诱导时长对裂解率和Sb_ARS酶活力的均具有显著影响(P<0.05)。此外,与Mohajeri等的结果一致,甘氨酸浓度也大肠杆菌的异源蛋白表达及菌体裂解密切相关(P<0.05)。同时,除菌体培养时长对裂解率呈显著的负效应外,其他均对裂解率和Sb_ARS酶活力呈正效应。此外,接种量和IPTG浓度等2个因素对Sb_ARS酶活力呈显著的正效应,而甘油则对裂解率呈显著的负效应。

2.2 最陡爬坡试验和分析

根据PB设计结果选择菌体培养时长、IPTG诱导时长和甘氨酸浓度等3个因素作为后续最陡爬坡试验和中心组合设计的关键因素。由于IPTG诱导时长对裂解率及Sb_ARS酶活力等2个目标的效应方向不一致,爬坡试验主要针对菌体培养时长和甘氨酸浓度2个因素进行。序号4的试验组合的裂解率和Sb_ARS酶活力均达到了最高值,分别为87.62%±0.53%114.94%±0.28%。故选用实验4组合条件为后续试验设计的中心点。

2.3 响应面设计结果和分析

方差分析(见表6)显示,响应面二次回归模型中一次项和二次项均显著(P0.05),而交互项X2X3对裂解率和X1X2Sb_ARS酶活力均不显著(P>0.05)。分别去除该2项后,对Sb_ARS酶活力(YE)和裂解率(YL)分别进行拟合,得到二次回归模型:

二次回归模型存在着极显著的线性关系(P<0.001),决定系数R2分别说明筛选试验中94.27%97.65%的数据可以由模型来解释,模型试验误差在可接受的范围之内。此外,失拟不显著(P>0.05),表明模型对本试验的拟合度良好。模型(56)能代替真实试验点对Sb_ARS酶活力和裂解率的分析和预测。

通过绘制Sb_ARS酶活力和裂解率的等高线图和响应面图,可以更加直观看出各因素之间的交互作用。由图1-A可知:当甘氨酸质量分数为0.90%时,菌体培养时长处于6.56.9 hIPTG诱导时长处于2.485 h,裂解率可达89%以上。当IPTG诱导时长为5 h时,甘氨酸质量分数处于0.90%1.07%,菌体培养时长处于6.56.9 h,裂解率也能达到89%以上(见图1-B)Sb_ARS酶活力见图1-C,当IPTG诱导时长处于5 h时,菌体培养时长处于6.57.34 h,甘氨酸质量分数控制在0.90%1.07%时,Sb_ARS酶活力可达115%以上。当菌体培养时长处于6.5 hIPTG诱导时长处于5.006.26 h,甘氨酸质量分数处于0.90%1.07%Sb_ARS酶活力可达115%以上(见图1-D)

2.4 线性加权多目标优化分析及验证试验

通过对二次回归模型进行求导,计算出不同权重下最优化结果。Sb_ARS酶活力和裂解率的最大估计值分别为118.60%90.18%(见表7)。将Sb_ARS酶活力和裂解率各赋予相同的权重并进行多目标优化后,求解可得总体最优值,即Sb_ARS酶活力和裂解率可同时达到117.86%89.96%

为验证优化条件的可行性,将表达条件定为菌体培养时长6.8 hIPTG诱导时长4.6 h、甘氨酸质量浓度1.0 g/L3次平行试验后,发现Sb_ARS酶活力和裂解率的测量值与估计值的相对误差不显著(P<0.05),表明通过线性加权多目标优化Sb_ARS在大肠杆菌中双控异源表达具有实际意义。

3 结论

本研究将多种试验设计方法相结合对Sb_ARS在大肠杆菌的双控异源表达条件进行了多目标优化。首先,通过PB试验设计筛选出与大肠杆菌的双控异源表达中Sb_ARS酶活力和裂解率均密切相关的因素。其次,依次通过最陡爬坡设计及中心组合响应面设计对菌体培养时长,IPTG诱导时长和甘氨酸质量分数等3个因素进行建模和优化,得各优化目标的最优条件。最后,通过线性加权多目标优化,最终获得Sb_ARS在大肠杆菌中进行双控异源表达最优化条件:在添加1.0 g/L甘氨酸的LB-Amp培养基中30 ℃培养6.8 h,加入终浓度为0.8 mmol/LIPTG,于30 ℃诱导Sb_ARS表达4.6 h,再于38 ℃进行热诱导SRRz 表达2 hSb_ARS酶活力和裂解率可同时达到(117.12±0.13)%(89.21±0.35)%

通过进行系统的多目标优化,实现了Sb_ARS在大肠杆菌中双控异源表达的Sb_ARS酶活力和裂解率的总体最优化,成果可为新型除草剂高粱素的生物合成奠定理论基础。

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