拟除虫菊酯类农药通用人工抗原合成及免疫原性鉴定

2015-10-19

    拟除虫菊酯类农药因其广谱高效的生物活性、较高的环境相容性等特点而被广泛应用于农业害虫、卫生害虫防治及粮食贮藏中[1]。拟除虫菊酯农药是一类具有神经毒性的杀虫剂,它对水生生物毒性比较大,对蜜蜂、家蚕高毒,对哺乳动物也有一定的毒性作用[2]。拟除虫菊酯农药可能对非靶标生物存在内分泌干扰、免疫毒性、神经毒性、发育毒性等多种潜在毒性[3]。拟除虫菊酯农药对哺乳动物的毒性作用是由于长时间接触低剂量菊酯类化合物引起的,毒性作用的严重程度是正比于神经组织中的拟除虫菊酯类化合物的浓度[4]。由于拟除虫菊酯农药的不合理使用,使得农副产品和食品中农药残留问题日益严重,由此引发的农药急性中毒或蓄积毒性均对人们的身体健康造成诸多影响。因此严格控制食品、农副产品中的农药残留十分重要。

    目前,拟除虫菊酯农药残留检测的技术包括仪器检测技术、传感检测技术和免疫检测技术。其中应用最为广泛的是仪器检测技术,包括气相色谱法(GC)[5]、高效液相色谱法(HPLC)[6]和毛细管电泳法(CE)[7]。仪器检测的优点在于检测的重复性好和灵敏度高,适用于样品的准确检测。但是这些仪器分析方法需要经过复杂的样品前处理,耗时耗力,而且会造成痕量农药残留的丢失。此外,仪器分析方法很难实现对样品的快速、低成本、高通量和现场检测的要求。免疫检测技术中应用最为广泛的是酶联免疫分析(ELISA)技术,相比传统的仪器分析方法,ELISA可以实现对样品的简便、经济、高通量和现场检测[8]。许多拟除虫菊酯农药都已经建立了酶联免疫分析方法。Zhang[9]报道了针对几种常用拟除虫菊酯农药的多残留酶联免疫分析方法;Wengatz[10]报道了针对甲氰菊酯的酶联免疫分析方法;Lee[11]应用多克隆抗体技术建立了针对溴氰菊酯的免疫分析方法;Shan[12]建立了检测拟除虫菊酯人体代谢产物的免疫分析方法。Chen[13]利用单克隆抗体技术开发出特异性检测高效氯氟氰菊酯农药残留的分析方法。在已被开发的拟除虫菊酯类化合物免疫分析方法中,多采用多克隆抗体或单克隆抗体技术来制备单一特异性抗体,以此类抗体开发的免疫分析方法只能检测单一的或几种拟除虫菊酯类化合物,无法对多种拟除虫菊酯类农药残留进行平行检测。

    拟除虫菊酯类农药按照结构分类可以分为2种,分别为不含氰基的Ⅰ类和含有氰基的Ⅱ类。常用的拟除虫菊酯农药的化学结构中普遍含有三元环、双键、间苯氧基苯、氰基等[14]。传统的半抗原设计中为了防止半抗原在偶联过程中被载体蛋白包埋,会设计1-4个碳长度的碳臂,但是近年来有研究发现,过长碳臂的存在会降低抗体的效价,1-2个碳的碳臂反而会获得较高效价的抗体[15]。因此本研究的目的就是依据拟除虫菊酯农药共性结构设计合成出多个通用人工抗原,并对其免疫活性进行初步的检测,为以后制备拟除虫菊酯类农药簇特异性抗体,开发拟除虫菊酯类农药多残留免疫分析方法打下基础。

    1 材料与方法

    1.1 供试材料

    1.1.1 试剂

    对苯氧基苯甲醛、对苯氧基苯甲醇、对羟基甲苯、二氯亚砜、2,2,3,3-四甲基环丙烷甲酸、反式菊酸、三氯化钌、高碘酸钠(均为AR),成都西亚试剂公司;98%氯氰菊酯原药,南京红太阳公司;牛血清蛋白(BSA)、多聚赖氨酸(PLL),美国MP公司;弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、辣根过氧化物酶(HRP),美国Sigma公司;其他试剂均为市售分析纯。

    1.1.2 试验动物

    Balb/c小鼠(雌性,8周龄)12只,购自西安交通大学实验动物中心。

    1.2 拟除虫菊酯类农药通用半抗原的合成

    1.2.1 半抗原Hap1的合成

    称取3g 2,2,3,3-四甲基环丙烷甲酸溶于20mL无水二氯甲烷中,低温下缓慢滴加过量二氯亚枫,后向反应体系中加入2DMF,加热(60)回流2h,减压蒸馏除去多余的二氯亚枫和溶剂,得白色晶体状产物,产物直接用于下步反应。

    产物用10mL无水吡啶溶解,低温下加入到溶有2g对羟基苯甲酸的吡啶溶液中,室温反应4h,加热(50)反应4h,将吡啶减压蒸馏除去。后将混合物在3.6%的盐酸溶液和乙酸乙酯间进行萃取分配,收集乙酸乙酯相,水洗,无水硫酸钠干燥,减压浓缩得粗产物。硅胶柱层析法纯化,先后用石油醚、二氯甲烷、二氯甲烷:乙酸乙酯(4:1)进行梯度淋洗,收集二氯甲烷部分,浓缩后得淡黄色固体,即为产物半抗原Hap1。反应路线见图1

   

    1.2.2 半抗原Hap2的合成

    称取2.52g菊酸溶于20mL无水二氯甲烷中,低温下缓慢滴加过量二氯亚枫,后向反应体系中加入2DMF,加热(60)回流2h。减压蒸馏除去多余的二氯亚枫和二氯甲烷,得黄色黏稠状产物,产物直接用于下步反应。

    将上述产物用10mL无水四氢呋喃溶解,在低温下缓慢滴加到溶有2g对羟基苯甲酸的的无水吡啶溶液中,室温反应4h,加热(50)反应6h,减压蒸馏除去反应溶剂,后将混合物在3.6%的盐酸溶液和乙酸乙酯间进行萃取分配,收集乙酸乙酯相,水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩近干。用硅胶柱层析法纯化,先后用石油醚、二氯甲烷、二氯甲烷:丙酮(5:1)进行梯度淋洗,收集二氯甲烷部分,浓缩后的白色固体,即为产物半抗原Hap2。反应路线见图2

   

    1.2.3 半抗原Hap3的合成

    反应瓶中加入70mL四氯化碳、乙腈和水按照2:2:3的体积混合后配成混合溶剂。后向反应瓶中加入2.2g氯氰菊酯原药、0.12g水和三氯化钌、4.3g高碘酸钠,加热回流搅拌反应4h

    3.6%的盐酸溶液将反应体系的pH值调到2,将反应混合物在3.6%的盐酸溶液和二氯甲烷间进行萃取分配,重复萃取3次,合并二氯甲烷相,将二氯甲烷相水洗3次,无水硫酸钠干燥,减压蒸馏浓缩至近干。反应产物用柱层析法纯化,石油醚湿法装柱,以石油醚:乙酸乙酯(10:1)淋洗,收集,浓缩后得黄色油状液体,即为产物半抗原Hap3。反应路线见图3

   

    1.3 抗原制备与鉴定

    采用活性酯法[16]将半抗原Hap1Hap2Hap3与多聚赖氨酸(PLL)偶联合成免疫抗原,反应路线见图4。采用同样的方法将3种半抗原与牛血清蛋白(BSA)偶联合成包被抗原。反应结束,将偶联物用PB(0.01mol/LpH=7.4)溶液透析72h,每6h换液1次,除去未结合的小分子化合物。冻干,分装,-20℃保存。

   

    分别配制一定浓度的半抗原、偶联物、载体蛋白溶液,对比其紫外扫描图谱(200-400nm),以此鉴定半抗原是否和载体蛋白偶联。并在波长(280nm)下测定3者的紫外吸收值,根据3者的紫外吸收值计算其摩尔吸光系数(EM),根据式(1)[17]来估算半抗原和载体蛋白的偶联比。

   

    1.4 免疫

    皮下4点注射免疫8周龄的Balb/c小鼠。初次免疫用等体积弗氏完全佐剂乳化免疫原,免疫剂量为0.5mg/kg2周后进行加强免疫,用等体积弗氏不完全佐剂乳化免疫原,免疫剂量为1.0mg/kg。以后相隔2周加强免疫1次,共加强免疫4次。后隔1周,静脉注射进行冲击免疫,免疫剂量为1.0mg/kg3d后,小鼠眼球取全血,离心分离抗血清,加入甘油4℃保存。

    1.5 抗血清效价测定

    采用间接非竞争ELISA的方法测定抗血清效价,采用方阵实验法[18]对抗原最佳工作质量浓度进行测定。将抗血清用磷酸盐缓冲液(PBSpH=7.4)依次稀释,稀释倍数为200040008000160003200064000128000256000倍;包被抗原用碳酸盐缓冲液(CBSpH=9.6)依次稀释,质量浓度为50201052.5mg/L。将包被抗原稀释后4℃过夜包被,加入封闭液37℃封闭2h,以同源组合进行测定,依次加入系列稀释倍数的抗血清稀释液,37℃温育2h,加入酶标二抗37℃温育2h后加入底物显色液显色,20min后加入硫酸终止液终止反应,每个组合重复3次测定450nm下的吸光度值。当OD450nm值约为1.0时,包被抗原的质量浓度即为最佳工作质量浓度,抗血清的稀释倍数即为抗体效价[19]

    2 果与

    2.1 半抗原构鉴定

    合成的半抗原化合物采用高分辨质谱和核磁共振氢谱对其结构进行鉴定,其质谱和核磁数据见表1。通过质谱分析发现化合物的质谱最大分子离子峰与预计的产物最大分子离子峰分子量一致,通过核磁数据分析,推测化合物结构与预计产物结构一致,证明半抗原合成成功。

   

    2.2 抗原紫外光谱鉴定及偶联比测定

    采用紫外光谱扫描的方法对人工抗原进行鉴定,将半抗原、免疫原、载体蛋白的紫外扫描光谱进行对比(见图5),以免疫抗原Hap1-PLL为例:半抗原Hap1的最大吸收峰在275nm处,Hap1-PLL的最大吸收峰在267nm处,根据紫外吸收的加和性原理[20],分析认为这是由于载体蛋白PLL上偶联上半抗原后吸收峰叠加造成的最大吸收峰位移,从紫外扫描图谱还可以看出免疫抗原的紫外吸收光谱具有载体蛋白和半抗原的特征,吸光值明显变化,说明半抗原已与载体蛋白成功偶联。包被抗原鉴定同免疫抗原,经紫外光谱扫描法鉴定,3种包被抗原合成成功。通过计算得3种免疫抗原的偶联比约为24:121:118:13种包被抗原的偶联比约为12:116:110:1

   

    2.3 抗血清效价测定

    小鼠加强免疫后3d,取全血分离得到抗血清,分别命名为ant1ant2ant3。采用方阵实验法分别对3种抗血清及包被抗原的最佳工作质量浓度进行测定;以抗体稀释倍数为横坐标、OD450nm下的吸光值为纵坐标作图,试验结果见图6;从图中可看出吸收值大小随抗体稀释倍数的增大和包被抗原质量浓度的减小成明显下降趋势,包被抗原Hap1-BSAHap2-BSAHap3-BSA质量浓度为10mg/L时,OD450nm值均约为1.0,说明3种包被抗原的最佳工作质量浓度为10mg/L。方阵实验法优选出包被抗原的最佳工作质量浓度为10mg/L,在此包被抗原浓度下对3种抗血清效价进行测定,结果见表23种抗血清的效价依次是3.2×1043.2×1046.4×104

   

    3 论与讨论

    半抗原的设计应考虑待测物是单一化合物或是一类化合物,设计时应相应的突出单一化合物的特征结构或是一类化合物的共有结构,对应的产生的抗体分别为单一特异性抗体或是簇特异性抗体,簇特异性抗体可以用来识别一类结构相似的化合物,可用于多残留检测分析。本研究的目的是开发出多残留免疫分析方法,因此研究依据拟除虫菊酯类农药共性结构,设计的3种半抗原,半抗原Hap1Hap2结构中环丙烷和苯环是2类拟除虫菊酯农药化合物最基本的共性结构,苯环和环烷烃是刺激机体产生免疫应答的主要刺激基团,半抗原中含有此类基团可以提高抗体抗原的亲和性;半抗原Hap3中则含有Ⅱ类拟除虫菊酯农药中共有的氰基、间苯氧基苯、环丙烷基团,研究者采用同样的半抗原进行免疫反应,均取得了很好的效果[21-22]。半抗原结构经过质谱和核磁鉴定,证明半抗原合成成功。有研究表明拟除虫菊酯人工抗原的连接臂越短,免疫活性越好,抗体效价越高,分析原因是因为短链连接臂的刚性较大,半抗原不易被包裹在载体蛋白内部,特征分子结构充分展露,最合适的连接臂的长度针对不同的半抗原结构会有所不同,但连接臂一般为非极性的,不应该含有苯环、杂环等高免疫活性的基团,本研究将3种半抗原通过一个碳链的短臂和载体蛋白偶联,3种抗血清的效价都达到104级别。拟除虫菊酯均为小分子化合物,相对分子质量一般小于1000,是不具备刺激机体产生针对特定化合物结构的抗原决定簇的免疫原性,因此必须将小分子化合物同大分子物质偶联后才能使得抗原具有刺激机体产生抗体的能力,本研究采用多聚赖氨酸(PLL)作为载体蛋白,PLL与牛血清蛋白(BSA),卵清白蛋白(OVA)相比,活性基团更多,可以结合更多的半抗原分子,有助提高免疫应答的效果。经紫外扫描鉴定,人工抗原制备成功,且免疫抗原与包被抗原的偶联比符合下一步研究要求。将小鼠免疫后,获得3种抗血清,分别对3种抗血清包被抗原的最佳工作浓度进行优化,确定3种抗血清在包被抗原浓度为10mg/L时,3种抗血清的效价依次是3.2×1043.2×1046.4×104,结果证明3种人工抗原均具有很高的免疫原性,为以后制备拟除虫菊酯类农药簇特异性抗体,开发拟除虫菊酯类农药多残留免疫分析方法打下基础。

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