大黄牡丹汤调节TLR/MyD88 /NF-κB-p65 信号治疗对急危重症患者急性肠功能障碍的临床研究

2019-01-14

急危重症患者均伴随不同程度的胃肠道功能障碍,尤其在应激状态下机体血流重新分布,引起各器官组织缺氧缺血,而肠道又是对缺氧缺血状态极为敏感部位,因此在患者应激状态下肠道器官最易受损,引起肠道功能障碍。若不能给予及时有效纠正,患者肠道通透性会增加,内毒素及细菌会发生移位,并刺激炎性因子大量生成,导致全身炎性反应综合征,甚至引起多器官功能衰竭。目前,临床对于胃肠道功能障碍大多给予常规药物对症治疗,但效果不佳,而中医药应用于急危重症患者应激状态下肠道屏障功能的治疗有一定效果。

大黄牡丹汤源自《金匮要略》,由大黄、牡丹皮、桃仁、冬瓜仁、芒硝组成,为历代治疗肠痈的代表方剂。方中大黄清热解毒、祛痰通便,为君; 芒硝助大黄清热解毒、泻下通便,为臣; 桃仁、牡丹皮活血化瘀,为佐; 冬瓜仁排脓散结,为使,诸药合用,攻积破瘀、排脓消肿,使肠道之热毒瘀血从大便而下,则脓毒可化,痈肿可消。在无锡市中医医院临床应用中发现,大黄牡丹汤可显著降低危重症患者急性肠功能障碍时胃肠功能障碍评分,具有良好的疗效。本研究将考察大黄牡丹汤是否通过调节TL/MyD88 /NF-κB-p65 信号调节炎症来发挥治疗急危重症患者急性肠功能障碍的作用,以期为该方相关治疗提供理论依据。

1 材料

1. 1 仪器680 型酶联免疫检测仪( 上海众生声明科学发展有限公司) ; Master-D UVF 超纯水机( 上海和泰仪器有限公司) ; SK-O180-E 圆形摇床( 大龙医疗设备有限公司) ;EPS300 电泳电源、VE-180 垂直电泳槽、5300 凝胶成像系统( 上海天能科技有限公司) ; FS-500 封口仪( 德清拜杰电气有限公司) ; D3024 微量高速冷冻离心机( 美国Scilogex 公司) ; ELX808 酶标仪( 美国BioTek 公司)

1. 2 试药大黄牡丹汤由无锡市中医医院提供。SOD 检测试剂盒( 浙江爱康生物科技有限公司,批号20160810) ;MDA 检测试剂盒( 中生北控生物科技股份有限公司,批号201605002) ; IL-1β、IL-6IL-10TNF-α、TL2TL4MyD88NF-κB-p65p-NF-κB-p65 酶联免疫吸附测试盒( 武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司) ; TL2 兔源一抗批号0031TL4 兔源一抗批号0011MyD88 兔源一抗批号0023NF-κB-p65 兔源一抗批号0001; p-NF-κB-p65 兔源一抗批号0002 ( 美国Cell Signaling Technology 公司) ; HP 修饰的羊抗兔第二抗体( 美国Proteintech 公司,批号2031)

2 方法

2. 1 一般资料及分组收集2014 12 月至2016 2 月入住南京中医药大学附属无锡医院重症监护病房( ICU) 的危重症患者,入选标准: 年龄在18 岁以上,性别不限,急性生理与慢性健康评分( APACHEⅡ评分) 15 ; 排除标准: 妊娠期和哺乳期妇女,恶性肿瘤患者,发病前有慢性肾功能不全并需血液透析的患者,肠梗阻、消化道出血、伴有慢性胃肠道疾病患者。共纳入57 例患者,随机分为2组,对照组30 例,其中男性15 例,女性15 例,年龄( 74. 5 ± 12. 1) 岁,常规治疗; 大黄牡丹汤组27 例,其中男性16 例,女性11 例,年龄( 76. 8 ± 8. 1) 岁,在常规治疗的基础上加用大黄牡丹汤,2 组年龄、性别组成均无显著性差异( P 0. 05) ,均治疗7 d。此外,再选择16 名健康成年人作为正常组。

2. 2 血清指标检测取患者静脉血2 mL,离心后取血清,1 mL 离心管将其分装,置于- 80 ℃冰箱中保存待检。然后,生化试剂盒检测患者血清中SOD 活性及MDA 水平,ELISA 试剂盒检测患者血清中IL-1β、IL-6IL-10TNF-α、TL2TL4MyD88NF-κB-p65p-NF-κB-p65 水平,详细方法参考相应试剂盒说明书。

2. 3 蛋白印迹检测取患者血液白细胞,3 000 r /min 离心,收集中间层白细胞,等渗PBS 1 次,再次离心收集白细胞至新EP 管内,WB 裂解液冰上裂解细胞30 min4 ℃、12 000 r /min 离心5 min,收集上清,Bradford 法进行蛋白定量,加入上样缓冲液并煮沸蛋白10 min,取等量总蛋白进行SDS-PAGE 电泳,将蛋白转移至PVDF 膜上,5%脱脂奶粉封闭液封闭2 h,根据Marker 所示分子量剪开PVDF 膜,分别加入GAPDH ( 1 10 000 ) TL2 ( 1 1 000) TL4 ( 1 500) MyD88 ( 1 500) NF-κB-p65( 1 1 000) p-NF-κB-p65 ( 1 1 000) 抗体,4 ℃孵育过夜,TBST 清洗PVDF 3 次,每次10 min,之后羊抗兔二抗( 1 10 000) 孵育2 hTBST 清洗PVDF 3 次,每次10 min,凝胶成像体统化学发光成像。然后,分析蛋白电泳条带,并导出数据。

2. 4 统计学分析通过SPSS 22. 0 软件进行组间的单因素方差分析,数据均以(` x ± s) 表示。P 0. 05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3. 1 大黄牡丹汤对SOD 活性、MDA 含有量的影响表1显示,与正常组比较,对照组SOD 活性显著降低( P 0. 01) MDA 含有量显著升高( P 0. 01) ; 与对照组比较,大黄牡丹汤组SOD 活性显著升高( P 0. 01) MDA 含有量显著降低( P 0. 01)

3. 2 大黄牡丹汤对IL-1β、IL-6IL-10TNF-α、TL2TL4MyD88NF-κB-p65p-NF-κB-p65 水平的影响表2 3 显示,与正常组比较,对照组IL-1β、IL-6TNF-α、TL2TL4MyD88NF-κB-p65p-NF-κB-p65 水平显著升高( P 0. 01) IL-10 水平显著降低( P 0. 01) ; 与对照组比较,大黄牡丹汤组IL-1β、IL-6TNF-α、TL2TL4MyD88NF-κB-p65p-NF-κB-p65 水平显著降低( P 0. 01) IL-10 水平显著升高( P 0. 01)

3. 3 大黄牡丹汤对TL2TL4MyD88NF-κB-p65 p-NF-κB-p65 蛋白表达水平的影响图1 显示,与正常组比较,对照组TL2TL4MyD88p-NF-κB-p65 蛋白表达水平显著升高( P 0. 01) NF-κB-p65 蛋白表达水平无显著变化( P 0. 05) ; 与对照组比较,大黄牡丹汤组TL2TL4MyD88p-NF-κB-p65 蛋白表达水平显著降低( P 0. 01) NF-κB-p65 蛋白表达水平无显著变化( P 0. 05)

4 讨论

机体在受到外部感染、严重创伤等疾病时,自身防御机制激活,免疫细胞会释放各类细胞因子,大量炎症因子释放可导致器官的微循环障碍,肠道组织因微循环血管丰富而最先被涉及,胃肠功能障碍极易发生。本研究首先测定了反映氧自由基对组织损伤程度的2 个指标SOD MDA,其中前者活性的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力; 后者作为一种脂质过氧化物,其含有量的高低可反映机体脂质过氧化水平,间接反映出机体细胞受自由基侵害的严重程度,结果显示给予大黄牡丹汤治疗后,急性肠功能障碍的危重患者血清中SOD 活性显著升高,MDA 含有量显著降低,表明该方可使氧自由基损伤减少,具有显著抗氧化能力。

NF-κB 作为一种多能转录因子蛋白,具备广泛的生物活性,它是肠道免疫功能相关的许多基因表达的关键调节因子,应激状态下可被激活诱导白介素、TNF-α、集落刺激因子、黏附分子表达,同时也可升高参与炎症反应的放大与级联效应多种酶表达。在重症感染时,NF-κB更是处于细胞因子产生过程的枢纽地位,当促进细胞因子释放时,多种因子又会反过来激活它,结果必然进一步调节各种炎性基因转录表达,引发并扩大炎症反应,导致疾病发生和加重。由于NF-κB 激活是目前所认识的导致肠道炎症损伤的重要通路,因此本研究也以这条通路出发,观察大黄牡丹汤对其调节作用。

给予大黄牡丹汤治疗后,患者血清中IL-1β、IL-6TNF-α、TL2TL4MyD88NF-κB-p65p-NF-κB-p65水平显著降低而IL-10 水平显著升高,表明该方在降低促炎因子水平的同时升高抗炎因子水平,在体内发挥了调节机体炎症的作用。TLs 通过自身LRRs 结构域识别病原体相关分子模式,刺激炎症因子生成,参与病原体杀伤,其过度活化和炎症因子大量释放可引起脓毒血症。集下游接头分子MyD88 /TIF 的募集是信号通路活化的关键步骤,除TL3 活化募集TIF 外,其余TLs 活化后都募集MyD88,当机体在受到外部感染、严重创伤等因素时,自身防御机制会被激活,免疫细胞释放各类细胞因子并激活TLs,导致MyD88 招募,最终激活NF-κB 诱导激酶( NIK) I-κB 激酶( IKK) ,同时NF-κB 被激活,而且TLs 负向调控的缺失可导致炎症过度放大。本研究检测了患者血液白细胞中TL2TL4MyD88NF-κB-p65p-NF-κB-p65 蛋白表达,发现TL/MyD88 /NF-κB-p65 信号在患者体内被激活,而给予大黄牡丹汤治疗后其相关蛋白表达将受到抑制。

中医认为,肠功能障碍可导致脘腹胀满,不排便,无矢气; 肠功能衰竭则多为热毒蕴结、气滞血瘀、积滞内停,病理中心为毒瘀互结所致,其治宜清热活血、解毒通瘀、泻下积滞。现代医学发现,危重症患者发生急性肠功能障碍时体内炎症增多,TL/MyD88 /NF-κB-p65 信号被激活,导致炎症进一步累积。本研究结果表明,大黄牡丹汤可能通过调控TL/MyD88 /NF-κB-p65 信号通路来抑制体内炎症发生发展,从而达到治疗急性肠功能障碍的目的。

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