烟草中茄尼醇的提取研究进展

2019-12-04

我国每年有大量的烟草废料产生,其中包括大量的低次烟叶。合理处理这些烟草废料不仅可以带来经济效益,而且可以减轻环境压力。茄尼醇是一种萜烯类化合物,在烟草中的含量最高,可以达到烟草干重的4. 13%,以游离态和化合态两种形式存在,化合态约占茄尼醇总量的9%

 16%,以酯的形式存在。茄尼醇主要存在于烟叶中,在上部叶、中部叶和下部叶中的含量逐渐降低,茎中也有较高含量的茄尼醇。Rowland 等于1956 年首次从烟草中提取分离得到茄尼醇,提取量约为干燥烟草重量的0. 4%。纯品茄尼醇为白色蜡状固体,具有抗菌、消炎、抗癌和止血等功效,同时茄尼醇也是合成辅酶Q10、抗溃疡药物、维生素K2等医药产品的重要中间体。茄尼醇的提取方法有溶剂浸提法、超临界CO2法、超声波辅助提取以及微波辅助提取等。常用的有机溶剂有乙醇、石油醚、甲醇、丙酮以及正己烷等。根据相似相溶原理,提取弱极性的茄尼醇应该选用弱极性溶剂。但是弱极性溶剂,如石油醚和正己烷,对植物细胞组织的穿透性不如甲醇等极性偏大的溶剂。有文献报道,甲醇的提取效果较好但毒性大; 正己烷不仅提取率高而且其潜热比甲醇低3 倍,减少了能源消耗,所以正己烷比较适用于工业提取。茄尼醇的分离纯化方法主要有重结晶法、柱色谱分离法、分子印迹技术、分子蒸馏技术等。

1 从烟草中提取茄尼醇

1. 1 烟草预处理

由于烟草中含有大量的化学物质,在提取过程中多种化学物质被同时提出,为了减少后续除杂工作,必须对烟草进行预处理。Wang 等研究发现,使用体积比为4∶6的正己烷和95%乙醇溶解预处理烟草,可以将茄尼醇的选择性从0. 1 提高到0. 44。张歆等在提取前通过加入去离子水并搅拌,可以除去其中的柠檬酸、烟碱、无机盐等水溶性杂质。孙银合等在提取前进行氨浸预处理,通过该步骤可以有效去除木质素,破坏烟草细胞壁结构,将茄尼醇酯有效地转化为游离态茄尼醇,促进茄尼醇的释放,将茄尼醇的提取率提高到104. 63%± 2. 44%( 提取率超过100%是因为氨浸促进了以化合态形式存在的茄尼醇转化为游离态茄尼醇,起到皂化的作用,下同) ,浸膏纯度提高到21. 03%±0. 6%,杂质减少也简化了后续纯化过程。烟草的烘烤过程会提高烟草中茄尼醇的含量,且不同的烟草以及不同的烘烤方式对茄尼醇含量提高效果不同。

1. 2 有机溶剂提取法

常见的溶剂提取法有热回流法、浸提法、连续热回流法、渗漉法等。溶剂浸提法是传统的提取茄尼醇方法,操作简单但需要消耗大量溶剂且浸提时间较长,国内外多使用正己烷或甲醇作为提取溶剂,但正己烷价格较贵且沸点偏低易挥发,甲醇毒性较大。为了寻找高效的提取溶剂及方法,提高产率、降低生产成本,国内外学者做了许多相关研究。

Tang 等通过回流法分析了不同溶剂的提取能力,发现石油醚和正己烷具有良好的提取能力,而且提取后的杂质较少。Schoitzhauer 等使用石油醚萃取烟叶,将萃取物通过硅酸柱层析分离得到8 个主要部分,再将所得到的分离物热解,而后将热解产物经硅酸柱层析和凝胶过滤得到多环芳香烃。经检测,多环芳香烃中含有30%的茄尼醇。由此可见,石油醚能从烟叶中有效提取茄尼醇。姚文等对比正己烷、6#油和SOT 溶剂体系对茄尼醇的提取效果发现,SOT 溶剂体系无论溶剂回收率还是提取能力均高于另外二者,而且在加热时萃取能力提高14%~15%。SOT 溶剂体系提取茄尼醇具有工业应用潜力,但目前尚无更多的研究报道。

溶剂浸提法提取效果的影响因素有料液比、提取时间、溶剂类型以及提取温度等。高温下茄尼醇易氧化,因此提取温度不宜过高,而易挥发的溶剂会减弱提取效果。Yang 等对比了不同溶剂对从烟草中提取茄尼醇的效果,以溶剂比10∶1、温度50℃、提取时间4 h 进行实验,无论收率还是茄尼醇纯度,石油醚的效果均高于其他溶剂。以石油醚作为萃取溶剂,茄尼醇纯度和收率都随着溶剂比、温度以及提取时间的增大而得到提高,但提取过程参数过高会导致纯度和收率无明显提高甚至降低。由此得到最佳提取条件为溶剂比15∶1、萃取温度50℃、萃取时间4 h,在此条件下萃取两次得到的茄尼醇收率达到6. 39%,纯度达到57. 56%。

1.      3 超临界CO2萃取法

超临界CO2萃取法广泛应用于天然产物萃取,与传统方法相比,该方法不仅能够克服提取时间长、溶剂消耗量大等缺点,而且清洁环保、提取效率高。Grosso 等使用不同的模型对茴香、香菜等6 种植物挥发油萃取实验数据进行建模,均证明了超临界萃取的过程是由内部传质控制的,而不是解析过程。

在超临界流体技术中夹带剂扮演着十分重要的角色,它可以显著提高溶质的溶解度。由于CO2是非极性物质,对弱极性的茄尼醇提取有一定限制,所以需要使用夹带剂来辅助提取茄尼醇,无水乙醇是常用的夹带剂。Huang 等采用中心组合设计和响应面法相结合,研究了操作参数对茄尼醇提取率和抗自由基活性的影响,并优化了萃取工艺。实验使用质量分数23%的乙醇为夹带剂,得到相应的最佳工艺: 粗茄尼醇的最佳操作工艺为萃取温度45℃、萃取压力38 MPa、萃取时间2. 6 h,在此条件下茄尼醇的提取率达到96. 8%,纯度达到52. 3%;抗自由基活性的最佳操作工艺为萃取温度47℃、萃取压力36 MPa、萃取时间2. 5 h,在此条件下可得最高抗自由基活性57. 49%。使用超临界CO2技术萃取茄尼醇的同时,尼古丁也会被萃取出来。Ruiz -Rodriguez 等对该问题进行了研究,优化最佳操作参数以获得高茄尼醇/尼古丁比率的萃取物。实验表明,萃取物中尼古丁的含量受温度影响很大,在较低的温度下尼古丁含量较低,如: 在40℃ 和15 MPa 下萃取物中茄尼醇/尼古丁比率为12. 20;在25℃和8 MPa 下二者比率提高到18. 91。所以利用超临界CO2技术从烟草中萃取茄尼醇应该在低温高压下进行,但文中并未进行进一步实验以获得最佳萃取条件。Wang 等将CO2流速和粒径两个因素引入实验,探究了二者分别对茄尼醇收率和萃取速率的影响。实验表明,在实验条件范围内,茄尼醇收率随着粒径的增大而出现降低的趋势; 在萃取过程前期,萃取速率随着CO2流速的增大而显著增大,但在萃取过程后期,CO2流速对萃取速率几乎没有影响。

1. 4 超声波辅助萃取法

超声波辅助萃取技术是利用了超声波的机械效应、空化效应等优点。机械效应能够加强介质振动增强传质效果; 空化效应是利用介质内的微气泡在超声波的作用下产生高压形成微激波,促进有效成分的溶出。与传统溶剂提取法相比,超声波辅助萃取技术具有操作简单、提取杂质少、提取率高、提取温度低、提取时间短等优点,广泛用于植物有效成分的提取。Chen 等先对烟草粉末进行皂化再用正己烷萃取4 次,过滤得到的烟草滤渣用超声波辅助萃取3 次,发现滤渣中的茄尼醇已被完全萃取。张艺等通过单因素实验研究了各因素对超声波辅助萃取茄尼醇的影响。在实验条件范围内,茄尼醇提取率随提取次数、提取时间、提取温度以及料液比的增加而增加,但提取率随超声功率的增大出现先增加后降低的规律。通过优化的工艺条件为料液比1∶14,温度70℃,超声波功率120 W,提取60 min,重复萃取3 次,在该工艺条件下茄尼醇的平均提取率为92. 54%。

1. 5 微波辅助萃取法

由于微波良好的穿透性,减少了萃取过程所需要的时间,而且提高了萃取效率,降低了溶剂消耗量。微波辅助萃取法中溶剂的极性和渗透性对目标物的提取率有显著影响。当萃取溶剂的极性接近目标化合物的极性时,化合物的收率较高,渗透率也较高。良好的渗透性使溶剂自由穿过细胞壁抵达细胞内部,加速提取过程。乙醇能够很好地吸收微波能量,但对茄尼醇的萃取效果低于正己烷,正己烷对微波能量的吸收能力低于乙醇,故可通过不同比例的乙醇-正己烷混合溶液提高对茄尼醇的萃取能力和对微波能量的吸收能力。Zhou 等通过实验得到最佳溶剂为体积比1 ∶3的正己烷和乙醇混合溶液。实验将皂化和萃取同时进行,结果表明,不管是热回流法还是微波辅助提取,茄尼醇的提取效果均得到提高。但在最佳碱浓度下超声波萃取40 min,茄尼醇提取率即达到最大0. 91%,显著减少了提取时间。且在提取过程中加入NaOH 有效防止了后续分离提纯步骤中出现乳化现象。Zhou 等通过实验对比室温提取、热回流提取、连续提取以及微波辅助萃取从烟草中提取茄尼醇的效果,结果表明,微波辅助提取法提取率最高,提取时间最短,分别为1. 47%和30 min。

1. 6 其他提取方法

固相萃取技术预处理过程易操作、溶剂消耗量少、费用低,其应用于茄尼醇的提取研究鲜有报道。Tang 等提出了将固相萃取技术应用于从烟草中提取茄尼醇。选用硅胶为吸附剂,用丙酮洗脱。平均每克硅胶能从烟草提取物中吸附58. 5 ±1. 7 mg 茄尼醇。多次重复性实验,茄尼醇平均回收率达97. 5%。

Rao 等采用连续逆流萃取,粉碎后的粉末首先吸收蒸汽形成颗粒,在此过程中烟草中可溶于水的杂质将被分离,而后使用正己烷多级萃取。通过高效液相色谱法( HPLC) 检测,粗提取物、皂化后的提取液以及纯化后的茄尼醇均优于索氏提取。实验研究了颗粒大小、萃取溶剂和萃取时间对萃取效果的影响。结果表明,颗粒粒径越小茄尼醇收率越高,最佳粒径应小于3 mm; 实验所使用的甲醇、乙醇、正己烷、丙酮等溶剂均有较好的萃取效果; 在萃取4 h时茄尼醇的收率达到最大。

Zhao 等为了快速高效地提取茄尼醇,开发了鼓泡塔提取法。该设备主体由工作体积为50 L的玻璃圆筒容器、流量计和泵组成,向鼓泡塔中加入材料和萃取溶剂,然后由泵向鼓泡塔中供应空气。通过实验探索了提取溶剂、样品粒径、提取时间、空气流量以及料液比等因素对提取茄尼醇的影响,并得到最佳实验工艺: 选用粒径小于350 μm 的烟草粉末,用80%乙醇进行提取,空气流量为75 L /min,料液比为13 L /kg,提取54 min。并与渗漉法和连续提取法进行了对比,3种方法的提取率相近,但渗漉法需要24 h,连续提取需要6 h,鼓泡塔提取法大大缩短了提取时间。

为了提高从烟叶中提取茄尼醇的效率,祖元刚等使用鲜法匀浆技术从鲜烟叶中提取茄尼醇,得到较好的实验效果。该方法是将含水率为80%的鲜烟叶与溶剂置于匀浆萃取装置中,利用搅拌作用达到强化提取茄尼醇的目的。实验表明,该技术与超声波辅助提取、索氏提取和超临界CO2提取法相比,具有更高的提取率和更短的提取时间。

1. 7 提取液的皂化

皂化可将茄尼醇从化合态在一定程度上转化为游离态,从而提高茄尼醇的提取率。KOH 和NaOH都可以用来作为皂化碱。Chen 等使用乙醇为稀释剂,皂化碱为KOH,并以相对提取率为标准分析了皂化时间和碱浓度对皂化效果的影响。相对提取率随皂化时间和碱浓度的增加均出现先提高后降低的规律。由此得出最佳皂化时间为4 h,最佳碱浓度为20 mg /mL。皂化温度对皂化效果有重要影响,Gu研究了温度对皂化效果的影响,茄尼醇的纯度随着温度升高而提高,并在45℃时达到最大。由单因素实验得到最佳实验条件: 用5 g 含量为30%的茄尼醇作为原料,2. 5 g NaOH 溶于30 mL 乙醇,45℃皂化3 h,在此条件下茄尼醇的纯度提高到41. 9%。茄尼醇长时间在碱性环境下容易异构化,赵春建等使用动态皂化法提高了皂化效率,缩短了皂化时间。与传统的皂化方法相比,动态皂化法得到的烟草粗提物中茄尼醇含量提高了2. 94%,而且皂化时间仅为2. 5 h。

2 分离纯化烟草提取液中的茄尼醇

茄尼醇粗品中茄尼醇的含量较低,远不能达到作为合成辅酶Q10和维生素K2 中间体的要求。为了将茄尼醇的纯度提高到制药标准,分离纯化步骤十分重要。常用的分离提纯方法有重结晶技术、柱色谱分离技术以及分子蒸馏等方法。分子蒸馏是一种特殊的液-液分离技术,具有蒸馏温度低、传热效率高、分离效果好等优点,适合高沸点、易氧化物质的分离。但分子蒸馏技术要求高真空,设备投资大。钱超等将分子蒸馏技术应用于分离提纯茄尼醇。在最佳操作条件下( 蒸发压力10 Pa,蒸馏温度200

220℃,进料速率350

 400 mL /h,刮膜器转速300

 400 r /min,进料温度100℃) 茄尼醇的收率高达77. 1%,纯度最高可达99. 2%。

重结晶方法提纯操作简单,但溶剂消耗量大,得到的成品纯度低。Gu 等用含量20%~ 30%的粗茄尼醇作为原料,通过结晶法对其进行分离提纯,并研究了结晶溶剂、结晶温度和结晶时间对茄尼醇纯度和收率的影响。使用甲醇和乙醇作为结晶溶剂能得到较高的收率,分别为83. 46% 和83. 99%,而且甲醇作为结晶溶剂得到的茄尼醇纯度最高,为80. 13%,最佳结晶温度为-5℃,最佳结晶时间为3 h。

柱色谱法是利用被分离物质的化学和物理特性不同、在基质上的流动速度不同进而达到分离提纯的目的。Tang 等建立了一种提取分离茄尼醇的方法,将烟草提取物进行硅胶柱层析,并用体积比为90 ∶10 的石油醚-丙酮二元溶剂混合物洗脱除去部分杂质。用TLC 对洗脱液初步鉴定,将富含茄尼醇的洗脱液减压浓缩,得到纯度为83. 04%的茄尼醇。Hu 等使用柱层析法从烟草中同时提取茄尼醇和尼古丁,以V( 石油醚)∶V( 碱性乙醇) = 4∶6作为提取和洗脱溶剂,最终提取液分成两相,其中乙醇相用石油醚洗脱,然后合并石油醚相真空浓缩,得到茄尼醇粗品。粗茄尼醇经过硅胶柱色谱纯化,得到纯度为93. 1%的茄尼醇成品。大孔树脂是极性、非极性或轻微亲水性聚合物,具有高吸附能力,吸附分子可回收,成本相对较低,易于再生。在柱层析中大孔树脂是茄尼醇提纯常用的吸附剂,溶剂和温度对茄尼醇的吸附有着重要影响,低级链烷醇和低温条件有利于茄尼醇的吸附。大孔树脂类型以及树脂孔径大小、表面积同样对茄尼醇的吸附有着显著的影响,弱极性树脂对弱极性物质有很好的吸附能力。Du 等通过实验发现,SP850 型树脂的孔径小、表面积大,具有良好的分离茄尼醇的能力,选用该树脂进行实验,研究了进料浓度、流速和床高对吸附容量的影响,进而得到优化实验条件为进料浓度2 mg /mL、流速6 BV/h、床高15 cm。

Rao 等实验对比了3 种不同的提纯方法: 硅胶柱色谱分离、皂化后通过硅胶柱色谱分离以及皂化后重结晶。实验结果表明,先皂化而后通过柱色谱分离最终使用正己烷重结晶可以得到纯度98%以上的茄尼醇,其收率为2. 1%。正己烷的重结晶效果好于丙酮。

逆流色谱技术分离程序简单,而且可以防止由支撑体导致的样品失活、变性等问题,被广泛应用于复杂化合物的分离。高速逆流色谱和低速逆流色谱技术均在此基础上发展而来。Du 等将高速逆流色谱技术应用到茄尼醇的分离提纯中,以V( 石油醚)∶V( 乙醇)∶V( 甲醇) = 200∶1∶100 组成溶剂系统,用1 g 含量15%的粗茄尼醇作为原料,经过分离提纯得到121 mg 纯度为90. 7%的茄尼醇。低速逆流色谱应用于茄尼醇分离的报道较少,Zhao等使用3 g 含量15%的粗茄尼醇作为原料,经过低速逆流色谱分离后仅得到1. 5 g 含量26. 8%的茄尼醇。该方法提纯效果不理想,还需进一步的研究。

聚合物的合成是分子印迹技术的关键。影响分子印迹聚合物的因素主要有单体、交联剂、致孔剂的类型和用量,印迹聚合物的制备方法以及单体、模板分子和交联剂3 者的比例等。印迹分子技术应用到提取茄尼醇的报道不多。Ma 等通过实验发现,甲基丙烯酸甲酯( MMA) 对茄尼醇具有较高的吸附速率和洗脱速率,以MMA 作为聚合物单体,茄尼醇为模板,二甲基丙烯酸乙二醇酯( EDGMA) 为交联剂,三者物质的量比为6∶1∶30。结合高速色谱法在优化的实验条件下茄尼醇得率为2. 5%,纯度高达98. 4%。Long 等使用溶液聚合法合成茄尼醇分子印迹聚合物,并探讨了其吸附性能。研究发现,交联剂EDGMA 与功能单体丙烯酸( AA) 的物质的量比为8 时,分离度、茄尼醇的平衡吸附量以及三十烷醇的平衡吸附量达到最大。聚合物的合成时间为23 h、合成温度为60℃时,聚合物对茄尼醇的吸附性能最佳。引发剂的用量对聚合物的合成速率以及吸附效果都有着重要影响,当引发剂AIBN 与功能单体AA 的物质的量比为0. 45 时,吸附效果较好。目前已有使用聚合物共沉淀法大规模生产高纯度茄尼醇的报道。

3 烟草提取后的残渣处理

废次烟草经过提取茄尼醇、烟碱和蛋白质等后会产生大量的烟草残渣,从经济和环保的角度,合理处理烟草残渣是非常有必要的。目前烟草提取后的残渣主要用来制作饲料、活性炭、纸浆以及有机肥等。刘项以提取烟碱后的烟草残渣作为原料,使用化学法成功制备出吸附性能较好的活性炭。烟草中含有植物生长所需的氮磷钾等营养元素,提取后的烟叶残渣可以用来生产有机肥。云南呈源生物科技有限公司将提取茄尼醇后的烟叶残渣以及锅炉炉渣出售给有机肥厂,不仅减少了废物排放,而且带来经济收益。田浩等以提取茄尼醇后的烟叶残渣作为原料,经盐酸水解、活性炭脱色,在最佳工艺下氨基酸的收率达到86. 65%。Meher 等采用微生物降解的方式处理烟草废料生产沼气,将废次烟叶转化为生物质能源,也是一条资源重新利用的有效途径。

4 结语

( 1) 从烟草中提取并分离纯化得到高纯度茄尼醇已经实现工业化。从烟草中提取茄尼醇不可避免地使用大量有机溶剂,工业中常用的溶剂为正己烷,考虑到价格因素,丙酮和石油醚也可以作为提取溶剂以降低生产成本。在目前对有机溶剂的研究中发现,SOT 溶剂对茄尼醇的提取效果以及溶剂回收率均高于正己烷,可替代正己烷作为工业溶剂提取茄尼醇,但相关研究较少。

( 2) 茄尼醇的提取方法虽然有多种,但每种方法各有优缺点。有机溶剂提取法消耗大量溶剂,提取率低、提取时间长,但操作简单,无需昂贵的设备;超临界CO2提取法效率高、清洁环保,但是设备昂贵,而且提取物中含有大量尼古丁; 微波辅助提取法提取时间短、溶剂消耗量少、能大批量处理,但装备复杂、溶剂选择范围窄; 超声波辅助提取受超声波衰减因素制约,超声设备制造难度大、成本高,且超声波器件安全性难以保证。所以在提取方法的选择上需要根据生产规模需求、投资成本、环保等方面综合考虑。

( 3) 为了提高茄尼醇的收率,常常需要对茄尼醇提取液进行皂化。皂化时间长、茄尼醇收率高,但是茄尼醇长时间在碱性环境下结构会发生变化。所以皂化的研究应该侧重在保证茄尼醇不被破坏的情况下提高收率。制备高纯度的茄尼醇,分离提纯是最关键最复杂的一步。目前柱层析法可以制备高纯度的茄尼醇,但更换树脂、再生树脂操作繁琐、成本高; 重结晶法是操作简单、适合大规模生产的方法,但茄尼醇纯度很难达到制备辅酶Q10的要求; 分子印迹法制备高纯度茄尼醇具有能够大规模生产、产物纯度高、聚合物可以重复利用的优点。

( 4) 废次烟叶经提取后的废渣可以生产饲料、有机肥,经生物降解生产新能源等,使其得到更充分的利用。

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