(CN105685092B) 一种几丁质合成抑制类杀虫剂及其制备方法及应用

源语言标题
(CN105685092) Chitin-synthesized inhibitory pesticide and preparing method and application thereof
公开号/公开日
CN105685092 CN105685092 / 2019-01-11 2016-06-22
申请号/申请日
CN201511029003 / 2015-12-30
发明人
ZHANG WENQING LI TENGCHAO CHEN JIE FAN XIAOBIN QIU JIEQI
申请人
SUN YAT SEN UNIVERSITY
主分类号
IPC分类号
A01P-007/04 C12N-015/10
摘要
(CN105685092)
本发明提供了种几丁质合成抑制类杀虫剂,包括作为活性成分的双链RNA,所述双链RNA的转录模板的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。 本发明的几丁质合成抑制类杀虫剂对褐飞虱防治效果显著,而且不会产生抗药性和环境污染,不破坏生态环境,安全环保。
地址
代理人
(CN105685092B) LIU WAN ; GUANG ZHOU SINO PATENT & TRADEMARK AGENT CO LTD Reg. Nb: 44100
代理机构
优先权号
2015CN-1029003
主权利要求
(CN105685092)
1.一种几丁质合成抑制类杀虫剂,包括作为活性成分的双链RNA,所述双链RNA的转录模板的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
 所述几丁质合成抑制类杀虫剂的制备方法包括以下步骤:
 1)提取褐飞虱总RNA:取若虫,于液氮中研磨,用TRIzol法提取总RNA;
 2)合成cDNA第一链:将1μg 总RNA 反转录为 cDNA;
 3)制备褐飞虱几丁质合成酶A基因中间片段,以及含有该中间片段的载体;
 4)以所述步骤3)的含有褐飞虱几丁质合成酶A基因中间片段的载体为模板,扩增,得到目的片段;
 其中,所述步骤3)的具体操作如下:
 步骤1、聚合酶链式反应:试剂为模板cDNA 1μL、10μM的褐飞虱几丁质合成酶A基因特异性上游引物NlCHSA-F 1μL、10μM的褐飞虱几丁质合成酶A基因特异性下游引物NlCHSA-R 1μL、2×HiFi Taq PCR mix 12.5μL、双蒸水 9.5μL,总体积为25μL;上述聚合酶链式反应的具体步骤如下:将上述混合液95℃预变性5min,然后进入下列循环:95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸60s,共35个循环,最后72℃再延伸10min;其中,扩增褐飞虱几丁质合成酶A基因特异性片段的上游引物NlCHSA-F的序列为:5’-GAAGACAAGGCTGAGA AGG-3’;下游引物NlCHSA-R的序列为:5’-GGAATCGTTTGCGGAAGG-3’;
 步骤2、扩增产物纯化:使用Magen凝胶回收试剂盒纯化PCR扩增片段;
 步骤3、中间载体获得:将纯化产物按照下列连接反应体系,克隆到pMD-18T载体,转化大肠杆菌DH5α,在含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB平板上过夜培养;
 连接反应体系:
 纯化产物 3μL
 PMD18-T 1μL
 连接缓冲液 5μL
 双蒸水 补足10μL
 步骤4、质粒纯化:将菌落接种于LB液体培养基,37℃摇床过夜培养后收取菌液,抽提质粒;
 其中,所述步骤4)的具体操作如下:
 步骤1、设计以下特异性引物:
 dsCHSA-F: 5’-GAAGACAAGGCTGAGAAGG-3’
 dsCHSA-R: 5’-GGAATCGTTTGCGGAAGG-3’
 dsCHSA-T7F:5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAAGACAAGGCTGAGAAGG-3’
 dsCHSA-T7R:5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGGAATCGTTTGCGGAAGG-3’
 步骤2、含有褐飞虱几丁质合成酶A基因的质粒命名为pMDT-CHSA,以其为模板,使用上述引物分别按照以下反应条件扩增,得到目的片段:
 A反应体系如下:
 2×HiFi PCR mix 12.5μL,
 pMDT-CHSA质粒DNA 1μL,
 10μM dsCHSA-F 引物 1μL,
 10μM dsCHSA-T7R 引物 1μL,
 双蒸水 9.5μL,
 总体积 25μL;
 B反应体系如下:
 2×HiFi PCR mix 12.5μL,
 pMDT-CHSA质粒DNA 1μL,
 10μM dsCHSA-T7-F 引物 1μL,
 10μM dsCHSA-R 引物 1μL,
 双蒸水 9.5μL,
 总体积 25μL,
 PCR仪扩增程序:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸90s,30个循环;72℃再延伸10min;
 通过dsRNA合成试剂盒合成几丁质合成酶基因对应的双链RNA。
2.权利要求1所述几丁质合成抑制类杀虫剂在制备用于防治褐飞虱的药物中的应用。
3.使用权利要求1所述几丁质合成抑制类杀虫剂防治褐飞虱的方法,其包括:将所述几丁质合成抑制类杀虫剂单独混在饲料中,对褐飞虱进行饲喂。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述双链RNA在饲料中的终浓度为0.1 μg/μL至0.5 μg/μL。
5.一种组合物,其含有权利要求1所述的几丁质合成抑制类杀虫剂。
法律状态
GRANTED
专利类型码
B A
国别省市代码
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