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  • [资讯] 药物开发和分析与自然辩证法
    摘要:自然辩证法是马克思主义的自然哲学,科学哲学和技术哲学,是关于自然界和科学技术发展的一般规律以及人类认识和改造自然的一般方法的科学,是系统化的自然观,科学观和科学技术方法论。它是马克思主义关于人类认识和改造自然的已有成果的概括和总结,是随着科学技术发展和人类社会进步而不断丰富和发展着的开放着的开放的理论体系。 在药物的科学研究中,自然辩证法的原理对指导新药物的开发,药物的分析具有理论和实际指导作用。 1 新药物的开发 新药物的开发一直是药学领域的热门课题,这一工作带有相当大的开创性和挑战性,而要想在工作中事半功倍,并最终取得成功,必须运用科学的方法和理论。 1.1 科学选题 在科研中选题是关系到最终能否取得成果的一个决定性因素,在选题过程中:首先,要从社会需要出发,在一定程度上,需要是促进新事物出现和发展的源泉,因为只有是社会所需要的,有较高的利用价值,才有可能创造出比较好的经济效益和良好的社会效益,如新型抗生素的研究和在农药中除草剂和杀虫剂的研究一直是新药开发的热点。 其次,创新性原则:创新是推动科学技术与社会进步的法宝,是科教兴国的灵魂,也是国家民族振兴的灵魂,更是科学技术和社会生产发展的需要。新药一定要力求“新”,是以前所没有的,如研制出一种新的流感疫苗,或是对已有药物进行改性,当然,要想做到这一点,就必须进行充分的调研,减少工作的盲目性,避免没有价值的重复性劳动。 再次,必须以科学理论和事实为依据,不能异想天开,凭一时兴起,而要研制所谓的万能药,当然,我们都知道,根本就不会有包治百病的神奇药物,就像世界上根本不会有永动机一样。 最后,一定要根据自己的实际情况(主客观条件,所具备的实验条件等等),当然这并不是说主客观条件不好或是实验条件恶劣就一定作不出好的科研成果,如当年居里夫人在简陋的小木屋里提取出了世界上第一克的铀和钋。 1.2 科学的研究方法 在新药的开发中,一定要以科学实验和科学观察为依据。比如在实际过程中我们可以采用模拟方法,它是现代科学的核心方法,对科学研究有着重要意义,在新药开发中,凭借科学的实验,可以模拟研究对象的活动,在短期时间内重复对象的活动,也可以强化对象,如在进行药物疗效评价时,可以利用动物进行实验,通过一系列的方法,使实验动物符合一定的病理情况:人们研制出一种新药时,常常用小白鼠作为实验对象,以获取在人体中的相应数据。 另外,假设翔技术性的预测也常常能促进新药的开发,假设是根据已知的科学事实为原理,对所研究课题的一种假设性推测和说明。技术预测是指人们在技术领域,利用已有理论,方法和技术手段,根据技术的过去和现状寻求事物发展的规律性,并借此推测和判断技术发展趋势和未来状态。例如人们发现人体内病变部位一般来说温度比身体的其他部位要高一些,这样人们就可能利用温控材料,把药物包裹在温控材料中,在体内非病变部位药物并不释放,而当到达病变部位时温控材料熔化,药物被释放出来。通过这样的假设和技术预测,可以期待多种新制剂脱颖而出。 2 药物的分析 药物的开发和分析是密不可分的,在研制出一种新药时,首先要考虑药物本身的有效性和安全性,这就需要对药物进行分析,而药物分析的任务就是对药物(原料,制剂,制药原料及中间体等)进行检测和质控,以及药物在作用过程中所可能表现出来的一系列的症状进行分析。当今科学的发展推动了药物分析的发展,药物分析正处于迅猛的发展时期。 新的药物分析理论、方法、技术迅速发展,具有高能量、高灵敏、高选择性的优点,如用液相-电喷雾离子化质谱法(HPLC-ESI MS),选择离子检测(SIM),可测定样本浓度范围每毫克ng级乃至pg级,为低浓度生物样本测定提供了新方法。利用鲁米诺-H2O2-Cr(Ⅲ)化学发光体系测定药物试剂中的SD(SD-磺胺嘧啶是磺胺药物制剂中主要成分之一)该法就具有较高的灵敏度和较宽的线性范围,并且操作方便,非常适宜对药物制剂成分的测定。在示波极谱测定法测定螺内酯含量中,我们根据螺内酯是一种含有机硫的药物,可利用测定有机硫的方法测定,将螺内酯进行消解,使有机硫转化为硫酸根离子,然后加入过量的氯化钡溶液,使之生成沉淀,而过量的钡离子可用铬酸钾标准溶液滴定,用交流示波极谱图形的变化指示终点,从而计算螺内酯的含量,其方法简便,直观,结果准确。 分析仪器由自动化、数字化、仿生化和计算机化并向智能化、信息化方向发展:如近红外光谱技术与计算机和光导纤维技术相结合,采用投射,散射,漫反射等光学检测方法,可不用化学试剂,不进行样品预处理,直接对颗粒状,糊状等不透明的样品进行分析,为药物生产过程质量的实时在线分析,过程控制和无损的药品质量鉴定提供了一个很有前景的分析技术。再比如色谱-光谱的联用技术——与紫外光谱联用(HPLC/DAD),与质谱联用(HPLC/MS),与核磁共振波谱联用(HPLC/NMR)。这些技术使高分离性能的液相色谱技术与能够获取丰富化学结构信息的光谱技术相结合,已成为药物微量杂质,药物降解产物,药物生物转化产物(代谢产物)的分析鉴定,组合化学产物的高通量分析以及天然产物的化学筛选等在内的现代药学研究领域中最强有力的分析工具之一。 药物分析测定对象,内容亦有很大的扩展如对药物品型和构型研究,药物中存在的有关物质(含降解产物)结构研究,手性药物的分离分析,药物代谢研究,基因工程药物分析,复杂物资分离分析(含中药成分分析)。如在药物晶型研究中,胡昌勤等报道利用单晶X射线衍射,粉末X射线衍射,DSC和TGA等理化分析力,分析不同条件得到的头孢替唑钠晶体。目前对手性药物分析主要采用HPLC和HPCE法用HPLC法拆分对应体并进行定量测定,可分为手性固定相法和手性衍生化试剂(CDR)法和手性流动相添加剂法。 药物分析在现代药学科学中的地位和作用将是越来越清晰,正如国内著名药物分析专家安登魁在他主编的《现代药物分析选论》书中预期的那样:哪里对现代药物分析的方法和技术运用得及时恰当,哪里就可能对新药的研究与开发以及药物的合理应用打开一个可喜而崭新的局面。 科学技术与哲学历来是密不可分的,科学技术是哲学发展的基础,哲学对科学技术有指导作用。可以这么说,离开科学的哲学是空洞的,离开哲学的科学是盲目的。唯物主义哲学,可以推动哲学的发展,目前科技发展日新月异。我们的工作将面临各种严峻的挑战,用辩证唯物主义指导科研是我们走向成功的必由之路。 我们相信,随着现代药物分析的发展,未来药物的发展将会越来越快,品种也会越来越多,新品种大量出现,形式也将会更加丰富多彩。
  • [资讯] (上)红薯叶中黄酮类化合物的超临界提取研究
    摘要:甘薯又名红薯、白薯、番薯、地瓜等,为旋花科甘薯属一年生或多年生草本植物。目前,在我国各地均有种植。据现代医药研究表明,甘薯叶中富含黄酮类化合物,其所含有的黄酮类活性成分具有抗氧化、抗癌、免疫增强、抗突变等作用,甘薯叶黄酮不仅有显著的降血脂、血糖和治疗脂肪肝的效用,还能有效地提高机体内组织抗氧化能力,防止组织脂质的过氧化损伤。在医学上对治疗冠心病、癌症、脑血栓、消除自由基以及抗衰老等方面有显著效果;在食品工业上可用作抗氧化剂、色素和甜昧剂等。 甘薯是我国四大主要粮食作物之一,我国甘薯的总产量和种植面积均居世界首位。长期以来,人们利用的只是甘薯的块根,有关甘薯的研究较多,但对甘薯茎叶研究很少。因此,甘薯叶除部分地区作为饲料外,绝大部分被丢弃,造成了资源的极大浪费。为了充分利用甘薯叶这一资源,本实验采用超临界技术从甘薯叶中提取黄酮类物质,对甘薯叶进行有效的开发利用,提高甘薯叶的附加值,为进一步开发利用这一资源提供科学的理论依据。 1 实验部分 1.1 试剂与仪器 甘薯叶,于九月下旬自永州市农科所甘薯园区内采集,经漂洗,自然晾干,于65℃烘干,粉碎,过40目筛后置干燥器中备用;CO2(食用级,纯度≥99.5%),永州市医用氧气厂;芦丁对照品,中国药品生物制品检定所;亚硝酸钠、硝酸铝、磷酸氢二钠、柠檬酸、无水乙醇等均为分析纯;二次蒸馏水自制。 HA221-40-48型超临界萃取装置,江苏南通华安超临界萃取有限公司;UV-1700紫外可见分光光度计,日本岛津;30-B微型高效粉碎机,湖南长沙中南药机厂;标准分样筛,浙江中拓仪器有限公司;Mettler AE-240电子天平,梅-托上海仪器有限公司。 1.2 实验方法 1.2.1 样品溶液的制备 精确称取粉碎过40目筛的甘薯叶粉100g,装入500mL的萃取釜内,调节萃取釜至设定的参数,对萃取釜、分离釜、冷却釜分别进行加热和冷却,进行超临界萃取,每隔30min从分离釜收集萃取物,减压浓缩得样品溶液。 1.2.2 标准曲线的绘制 精密称取110℃条件下干燥至恒重的芦丁对照品29.4mg,用体积分数为50%的乙醇溶解并定容至100mL量瓶中,摇匀即得浓度为0.294mg/mL的芦丁标准溶液。 用移液管分别精密移取芦丁标准液0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00,12.00、14.00、16.00mL芦丁标准标液于25mL容量瓶中,各加入质量分数为5.0%的NaNO2溶液1.0mL,摇匀,放置6 min后加入质量分数为10%的Al(NO3)3溶液1.0mL,摇匀,放置6min,再加入质量分数为5%的NaOH溶液4mL,用50%乙醇溶液定容至刻度,摇匀,放置10min后,以试剂空白为参比,于510nm波长处分别测定其吸光度A,以吸光度A对芦丁浓度Y进行线性回归,得回归方程: A=0.9437Y-0.0857,r=0.9998 1.2.3 样品中总黄酮含量的测定 精密移取“1.2.1”中的样品溶液适量,置50mL容量瓶中,按照与系列标准溶液相同的处理方法操作,测定其在510nm波长处的吸光度A值,按标准曲线法计算样品中总黄酮的含量,并釜下式计算总黄酮提取率: 黄酮得率(%)=黄酮类化合物质量/甘薯叶粉末的质量×100 2 结果与讨论 2.1 单因素试验 2.1.1 夹带剂种类的确定 超临界萃取甘薯叶中黄酮类化合物时,由于CO2为非极性溶剂,黄酮类物质具有极性,在其中的溶解度不大,单纯使用超临界CO2溶剂,使得萃取效率不高。因此,在超临界萃取过程中,加入一定的夹带剂来提高对黄酮类成分的溶解能力。实验选用醇类、酮类和酯类物质作为夹带剂进行试验。 称取甘薯叶粉样100g,装入萃取釜,设定萃取温度50℃,萃取压力24MPa,萃取时间180min,夹带剂用量为80mL,固定CO2流量为15L/h,改变夹带剂种类,循环萃取,结果见图1。 图1表明,从萃取黄酮得率的结果来看,甲醇作为夹带剂黄酮的得率最高,乙醇和甲醇比较接近,鉴于乙醇无毒,从价格和安全性来考虑选择乙醇作为夹带剂。
  • [资讯] (下)红薯叶中黄酮类化合物的超临界提取研究
    摘要:2 1.2夹带剂浓度的确定 在恒定其他因素不变的情况下,改变夹带剂乙醇的浓度,选用40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%不同浓度的乙醇作为夹带剂进行循环萃取实验,考察乙醇浓度的大小对黄酮得率的影响,结果见图2。 结果显示,在实验条件下,随着夹带剂(乙醇)浓度的增大,黄酮类化合物的得率先增大,后减小。乙醇浓度到80%时,黄酮得率最高,所以选取80%乙醇作为夹带剂。 2.1.3 夹带剂用量的考察 称取甘薯叶粉样100g,用80%乙醇作为夹带剂,控制CO2流量为15L/h,设定萃取温度50℃,萃取压力20MPa,萃取时间150min,改变夹带剂朋量进行循环萃取,实验结果见图3。 可以看出,随着夹带剂乙醇用量的增加,黄酮得率增加较快,至60mL时,黄酮得率达到一个较大值,继续增加使用量,得率上升很缓慢,可能是黄酮己大部分被萃取出来。 2.1.4 萃取压力对提取率的影响 压力和温度是超临界萃取中两个最重要的参数。在临界点附近,温度和压力的微小改变就可引起流体密度的显著变化,从而影响其溶解能力。 称取甘薯叶粉样100g,用80%乙醇为夹带剂,夹带剂用量为60mL,控制CO2流量15L/h,设定萃取温度50℃,改变萃取压力,循环萃取180min,实验结果见图4。 结果品示,萃取压力与黄酮得率呈正相关;当萃取压力超过30MPa,黄酮类化合物得率随压力的升高而缓慢递增。尽管压力提高时,提取率有所增大,但压力高,生产成本必然增加,同时不安全隐患加大。 2.1.5 萃取温度对提取率的影响的大小 萃取温度对萃取效果具有双重的影响。一方面,温度升高,分子运动速度加快,提高了物料的扩散系数,有利于黄酮类化合物的萃取;另一方面,温度升高又会降低CO2的密度及夹带剂的浓度,从而导致CO2溶解能力下降,对萃取不利。同时,温度过高还会破坏黄酮类化合物的生理活性。 称取甘薯叶粉样100g,用80%乙醇为夹带剂,夹带剂用量为60mL,控制CO2流量15L/h,设定萃取压力30MPa,改变萃取温度进行循环萃取180min,实验结果见图5。 由图5可以看出,在45℃之前随着温度高,提取率增大,当温度达到45℃时,提取率达到最大值,超过45℃时,提取率呈下降趋势。 2.1.6 萃取时间对提取率的影响 超临界流体萃取的过程就是黄酮类化合物在CO2流体中达到溶解平衡的过程,当超临界流体与黄酮类化合物达到溶解平衡时,萃取率一般达到较大值。 称取甘薯叶粉100g,用80%乙醇为夹带剂,夹带剂用量为60mL,控制CO2流量15L/h,设定萃取温度50℃,萃取压力30MPa,改变循环萃取时间,实验果见图6。 可以看出,当萃取时间达到150min时,黄酮得率达到较大值,继续延长萃取时间,能耗增加但萃取率增长缓慢。 2.2 正交实验设计 在单因素试验的基础上,选用80%乙醇为夹带剂,控制CO2流量为15L/h,以黄酮得率为考察指标,对萃取压力、萃取时间、萃取温度、夹带剂用量四因素进行正交设计实验,每个因素设定三个水平(见表1),以确定它们对超临界流体萃取效果的综合影响和超临界流体萃取的最优化工艺。 极差分析发现,四因素对超临界萃取甘薯叶总黄酮类化合物的影响程度依次为:萃取温度>萃取时间>萃取压力>夹带剂用量。因此在本实验条件下,超临界流体萃取甘薯叶总黄酮类化合物的最佳条件是:萃取压力30MPa、萃取温度50℃.100g甘薯叶粉中加入80%乙醇50mL作为夹带剂,循环萃取150min,黄酮的得率可达到6.25%。按最优工艺条件进行验证实验,重复3次,得到的黄酮得率分别为6.27%、6.23%和6.24%RSD为2.08%。 3 讨论 在对CO2流量的考察实验时发现,对于不同的压力,达到最佳萃取效果的流速是有所不同的,压力越高,达到最佳萃取效果的流速越低;萃取压力越低,达到最佳萃取效果的流速越大。在选定的实验条件下,15L/min的流速对黄酮的萃取效果较好,故作为实验流量。 4 结论 在对萃取压力、萃取温度、萃取时间、夹带剂种类与用量等单因素对黄酮提取率影响的基础上,设计正交试验,确定了CO2超临界流体萃取甘薯叶中总黄酮的最佳工艺条件:以80%乙醇作为夹带剂,夹带剂按夹带剂用量占原料质量的50%(V/W)加入,控制CO2流量15L/h,萃取压力30MPa、萃取温度50℃、循环萃取150min。 超临界CO2萃取不但可使植物细胞壁高度破碎,增加黄酮类物质与溶剂的接触面积和萃取通道,提高萃取率,同时还可使黄酮与纤维素结合力降低,提高萃取率。同时由于温度低,可以避免常规加热回流提取因温度高,受热时间长造成的热敏性活性成分的破坏。该提取工艺为我国丰富的薯叶资源在I业上的开发应用提供实验基础。
  • [资讯] (上)微波辅助提取枸杞中的总黄酮工艺研究
    摘要:1 材料与方法 1.1 材料与仪器 枸杞(产于甘肃白银景泰,干燥,粉碎40-60目);芦丁标准品(含量≥99%,UV)购自成都曼斯特生物制品有限公司。无水乙醇、乙醚、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。 WF-4000微波快速反应器(上海屺尧分析仪器有限公司),FA.1004电子分析天平(上海恒平科学仪器有限公司),U-2001紫外分光光度仪(日本HITACHI),RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),SHZ-H2循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂),MILLIPORE超纯水机,KQ5200DE超声波反应器(昆山市超声仪器有限公司)。 1.2 实验与分析方法 1.2.1 枸杞提取黄酮工艺流程图见图1。 1.2.2 检测波长的选择 精密称取于120℃干燥至恒重的芦丁标准品5.0mg,加入φ=80%的乙醇溶解,并定容至25mL容量瓶中,摇匀;制成0.2mg/mL的标准品溶液。吸取芦丁标准品乙醇溶液1.0mL置于25mL容量瓶中,加80%乙醇5.0mL,加入w-5%的亚硝酸钠1mL,放置6min,再加w=10%的硝酸铝1mL,放置6min,最后加w=4%的氢氧化钠10mL,如蒸馏水稀释至刻度,摇匀,放置15min。再以加80%乙醇5.0mL,加入w-5%的亚硝酸钠1mL,再加w=10%的硝酸铝1mL,最后加w=4%的氢氧化钠10mL,加蒸馏水稀释至刻度作空白对照,在200-600nm波长范围内进行紫外扫描,结果在510nm波长处有最大吸收峰,故该试验选取510nm为测定波长。 1.2.3 标准曲线的制作 精密称取芦丁10mg(120℃干燥恒重),用30%(体积分数,下同)乙醇溶解,完全转入100mL容量瓶,用30%乙醇定容,摇匀,此时每1mL含无水芦丁0.1mg。准确吸取上述芦丁溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0与5.0mL,分别置于10mL容量瓶中,各加30%乙醇成5mL,然后先加5%亚硝酸钠溶液0.3mL,摇匀,放置6min,再用10%硝酸铝溶液0.3mL,摇匀,再放6min,加4%氢氧化钠溶液4,用30%乙醇稀释至刻度,在波长510nm下,测吸光度(第一管作空白),以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法作线性回归,得出芦丁浓度C(mg/mL)与吸光度A的关系曲线,回归方程式:A=12.225C-0.0638,R=0.9998,线性范围为:0.01-0.05(mg/mL)。 2 实验过程 2.1 提取方法的筛选 称取一定量粉碎过筛的枸杞残渣(提取色素后的残渣)10.0g置于烧瓶中,溶剂采用96%工业乙醇,固液质量比为1:10;提取温度:75℃;采用不同的方法提取,提取次数:3次;合并滤液,真空浓缩液,真空干燥,得到产品,经紫外吸收光谱分析其结果见表1。 由以上实验结果可以看出:利用热回流的方法提取枸杞黄酮类化合物时获得的浸膏量太少,需要很长的时间才能充分提取;利用超声提取虽可以缩短提取时间,但是浸膏质量很少;利用微波提取获得的效果明显优于热回流法和超声波辅助法,得到的浸膏颜色深红,而且浸膏得率高,获得的总黄酮含量也较高。故选择微波热回流技术提取枸杞黄酮作为该提取工艺适合方法。 2.2 提取溶剂的筛选 称取一定量粉碎过筛的枸杞残渣10.0g置于烧瓶中,在固液比:1:10;提取时间:60min;微波功率:400W;提取温度:80℃的条件下,采用不同的浴剂提取,提取次数:3次;合并滤液,真空浓缩液,真空干燥,得到产品,经紫外吸收光谱分析其结果见表2。 由以上实验结果可以看出:用90%的乙醇和80%的乙醇进行提取时获得的浸膏得率较高,分别为61.19%、63.84%,但是枸杞中黄酮收率是用96%的乙醇进行提取时得到最高。而用乙酸乙酯和乙醇配比作为溶剂提取得到的浸膏量很少,而县黄酮的提取率也很低。因此利用枸杞残渣提取枸杞黄酮的溶剂选用96%工业乙醇。 2.3 不同温度对黄酮提取率的影响 称取一定量粉碎过筛的枸杞残渣10.0g置于烧瓶中(提取色素后的残渣),采用微波提取技术,改变提取温度,在提取溶剂:96%乙醇;圆液比:1:10;提取时间:60min;微波功率:400W;提取次数:3次;合并滤液,真空浓缩液,真空干燥,得到产品,经紫外吸收光谱分析其结果见表3。 由以下实验结果可以看出:随着温度的升高,浸膏得率与及枸杞中总黄酮的收率都随着增大。但温度达到90℃时,乙醇溶剂暴沸,造成乙醇溶剂损失,而且若提取温度达到90℃时,浸膏中总黄酮含量在减少,可能是因为黄酮在高温的情况下发生分解,所以反应的温度不宜太高。因此,枸杞中提取枸杞黄酮的提取温度应控制在为70-80℃较为适宜。 2.4 不同固液比对黄酮提取率的影响 称取一定量粉碎过筛的枸杞残渣10.0g置于烧瓶中(提取色素后的残渣),选用不同的固液比,采用微波提取技术,在提取溶剂:96%乙醇;提取温度:80℃;提取时间:60min;微波功率:500W;提取次数:3次;合并滤液,真空浓缩液,真空干燥,得到产品,经紫外吸收光谱分析其结果见表4所示。 由以上实验结果可以看出:不同固液比提取的总黄酮浸膏的得率与总黄酮的含量分析结果差别较大,其中,固液比为1:8以下进行提取时,提取的浸膏得率较低,其含量也最低,当固液比达到1:10以上时,提取的浸膏得率基本接近,提取的总黄酮浸膏的得率与总黄酮的含量差别不大。考虑溶剂的使用量和后续回收成本,因此,枸杞中提取枸杞黄酮的固液比选为1:10较为适宜。
  • [资讯] (下)微波辅助提取枸杞中的总黄酮工艺研究
    摘要:2.5 不同时间对黄酮提取率的影响 称取一定量粉碎过筛的枸杞残渣10.0g置于烧瓶中(提取色素后的残渣),采用微波提取技术,改变提取时间,在提取溶剂:96%乙醇;固液比:1:10;提取温度:80℃;微波功率:500W;提取次数:3次;合并滤液,真空浓缩液,真空干燥,得到产品,经紫外吸收光谱分析其结果见表5。 由以上实验结果可以看出:不同提取时间提取的枸杞黄酮浸膏与浸膏中总黄酮含量分析结果差别较大,其中,提取时间在60min以下进行提取时,提取的浸膏得率及含量随着时间的增加而增大,当提取时间达到60min以上时,浸膏中黄酮的含量降低。因此,枸杞中提取枸杞黄酮的提取时间选为60min较为适宜。 2.6 不同功率对黄酮提取率的影响 称取一定量粉碎过筛的枸杞残渣10.0g置于烧瓶中(提取色素后的残渣),采用微波提取技术,改变微波提取功率,在提取溶剂:96%乙醇;固液比:1:10;提取时间:60min;提取温度:80℃;提取次数:3次;合并滤液,真空浓缩液,真空干燥,得到产品,经紫外吸收光谱分析其结果见表6。由以上实验结果可以看出:不同微波提取功率条件下提取的枸杞黄酮浸膏得率与总黄酮含量分析结果差别很大,随着微波提取功率的增加,提取的浸膏得率和黄酮浸膏中的总黄酮含量也在增加,但是到了功率400W总黄酮含量降低了;因此,枸杞中提取黄酮的提取率选为400w较为适宜。 称取一定量粉碎过筛的枸杞残渣10.0g置于烧瓶中(提取色素后的残渣),采用微波提取技术,微波功率500W,固液比1:10,提取温度80℃,提取时间1h,以王业乙醇溶剂系统进行提取,提取次数:3次;合并滤液,真空浓缩液,真空干燥,得到产品,经紫外吸收光谱分析其结果见表7。 由表7实验结果可以看出:提取第三次时,提取的浸膏得率和浸膏中的总黄酮含量相对增加的幅度很小,考虑溶剂的使用量和后续回收成本,因此,采用微波提取技术提取枸杞中黄酮的提取次数定为2次较为适宜。 2.8 提取工艺的优化 2.8.1 正交实验方案设计 通过前期单因素实验,确定影响枸杞黄酮提取率和浸膏中的总黄酮含量的因素,除了溶剂之外,还有微波功率、提取温度、提取料液比、提取时间等因素的综合影响,为了获得生产枸杞黄酮的最佳工艺条件,采用正交实验进行设计进行优化分析。 以枸杞黄酮浸膏得率和浸膏中总黄酮含量为考察指标,以影响微波提取工艺技术的4个主要因素:固液比、提取功率、提取时间、提取温度,进行L9(34)正交试验设计,即四因素三水平,按照正交试验设计共进行9组试验,优化枸杞黄酮的浸提条件,正交试验因素水平见表8。 2.8.2 实验结果 实验结果见表9。 2.8.3枸杞黄酮提取工艺条件优化工艺重复性考察 称取一定量粉碎过筛的枸杞残渣3份,分别为50.0g100.0g150.0g,利用以枸杞黄酮浸膏得率和漫膏中总黄酮含量为评价指标,确定的最佳提取工艺条件:提取溶剂为工业乙醇溶剂体系为萃取溶剂;微波提取功率为:400W;料液比1:12;提取温度80℃;提取时间40min。进行对枸杞黄酮提取工艺条件的重复性试验。三组试验结果得到的黄酮浸膏得率、浸膏中总黄酮含量见表10。 由表10中的结果可知该提取工艺条件合理可行,重现性好。因此利用白银景泰枸杞为原料,提取枸杞黄酮的最佳工艺条件为:采用微波热回流提取技术,提取溶剂为工业乙醇溶剂体系;微波提取功率为:400W;料液比1:12;提取温度80℃;提取时间40min/次,提取次数2次,可实现枸杞黄酮浸膏得率62.72%,浸膏中总黄酮含量达2.69%的优化提取工艺。 3 结论 (1)以工业乙醇为萃取剂,采用微波提取技术利用提取枸杞色素后的枸杞残渣提取枸杞黄酮,实现了枸杞黄酮的收率和枸杞黄酮中总黄酮含量高的生产工艺技术。 (2)获得了以提取枸杞色素后的枸杞残渣为原料提取枸杞黄酮的最佳生产工艺及参数:采用微波热回流提取技术,提取溶剂为工业乙醇溶剂体系;微波提取功率为:400W;料液比1:12;提取温度80℃;提取时间40min/次,提取次数2次,可实现枸杞黄酮浸膏得率62.72%,浸膏中总黄酮含量达2.69%,枸杞残渣中总黄酮含量达1.69%的优化提取工艺。
  • [资讯] 使用液态BSU制备7-ADCA的工艺研究
    摘要:7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)是届一内酰胺类抗生素产业链的三大母核(6-APA、7-ADCA、7-ACA)之一,可用来合成十几种头孢菌素类抗生素药物,由青霉素G钾通过扩环重排转化为7-ADCA是当前普遍采用的方法。此生产方法中双三甲基硅脲(BSU)是一种必不可少的原料,在由青霉素G亚砜扩环重排制备头孢G酸时,必须首先将环上羧基酯化保护起来,否则会发生脱羧副反应,脱羧产物是没有生物活性的。酯化剂的选择不仅影响酯化和脱酯的难易及收率,还影响到扩环反应的选择性。经过多年的实验验证,BSU成为最广泛使用的硅烷类保护试剂,可以由HMDS和尿素合成,成本低廉。但是它的稳定性很差,易于分解而使硅烷化保护活性降低,应该现制现用。在制备BSU时,离心、干燥、分装在生产上操作比较困难,很难保证其稳定性,且危险性较大。为了降低生产成本,也为了保证BSU的稳定性,进行了使用液态BSU制各7-苯乙酰氨基脱乙酰氧基头孢烷酸的工艺研究。 1 实验部分 1.1 液态BSU的制备 1.1.1 化学反应式 采用六甲基二硅胺烷和尿素反应,以三甲基氯硅烷为催化剂,制得BSU。其中实际起作用的葱氯化铵。除了生成BSU的主反应外,还有竞争反应及BSU的分解及水解反应。 主反应: (CH3)3SiNHSi(CH3)3+NH2CONH2→[(CH3)3SiNH)]2CO+NH3 竞争反应: (CH3)3SiNHSi(CH3)3+2NH2CONH2→2(CH3)3SiN=C=O+3NH3 分解、水解反应: [(CH3)3SiNH]2CO→(CH3)3SiN=C=O+(CH3)3SiNH2 [(CH)3SiNH)]2CO+H2O→(CH)3SiN=C=O+(CH)3SiOH+NH3 1.1.2 实验 在干燥的1000mL三口瓶中加入33.4g尿素,750mL二甲苯,搅拌下升温,缓慢采出200mL二甲苯,检测采出二甲苯水分合格,降温至100℃以下,加入122mL六甲基二硅胺烷,1.1mL三甲基氯硅烧升温至回流反应2h,反应结束采出二甲苯200mL,降温至室温后取小样检测熔点,合格后密封备用。 1.2 7-苯乙酰氨基脱乙酰氧基头孢烷酸的合成在干燥的3000mL三口瓶中加入87g无水的青霉素G亚砜,1000mL二甲苯,搅拌下加入制备好的液态BSU,200mL二甲苯种洗BSU反应瓶。55℃水浴升温至50-52℃,保温反应2h。 反应结束后加入扩环催化剂,迅速升温至110℃,反应2.5h,反应过程用HPLC监测原料转化情况及扩环产物及脱羧副产物的生成情况。 反应基本结束后,将反应体系降温,加入200mL约60℃去离子水,加碱溶解,静止分相,二甲苯相用少量水洗,静止分相,合并水相,滴入稀硫酸调pH值至2.0,降温至室温,搅拌0.5h,过滤,水洗,抽滤,干燥得产品,收率85%。 2 结果与讨论 影响该反应的因素有BSU的加入量、BSU反应结束后二甲苯采出量、反应时间、酸析pH值。 2.1 BSU加入量对扩环反应的影响 BSU与羧基发生酯化反应,从而对羧基进行保护,同时它还能作为脱水剂在重排扩环时除去反应中的水,所以BSU的量增加,收率也增加,但当BSU的量增加到一定量时,产率变化不明显,由于BSU的价格较昂贵,占成本较多,不宜用量过高,因此采用BSU:亚砜(物质的量比)为2.3:1。为保证BSU的加入量,BSU制备结束后一定要检测熔点。结果见表1。 2.2 BSU反应结束后二甲苯的采出量对扩环反应的影响 BSU反应结束后剩余的硅胺会对扩环反应产生不利影响,故反应结束后采出一定量二甲苯将剩余的硅胺带出,经实验摸索,采出200mL即可。 2.3 反应时间对收率的影响 在催化剂的作用下,温度升到一定程度后开始发生扩环反应,反应时间的长短直接影响反应收率。时间过短,反应不完全;时间过长,副产物增加。用HPLC跟踪监测反应发现:反应2.5h时,原料峰较小,主产物峰最大,超过2.5h,原料峰降低,主产物峰也随之降低。故最佳反应时间为2.5h。结果见表2。 2.4 酸析pH值对收率的影响 随着pH值的降低,收率逐渐增大,但是考虑到pH值过低会有副作用的发生,因此选定pH值为2.0。结果见表3。 2.5 稳定工艺实验 将上述确定的工艺条件进行连续实验,收率均在85%以上。并且BSU的制备简单,用量低,降低了生产成本。 3 结论 使用液态BSU制备7-ADCA的最佳工艺条件:BSU:亚砜(物质的量比)为2.3:1,尿素:六甲基二硅胺烷的(物质的量比)为1:1.03,反应2h,反应结束采出—定量二甲苯;酯化反应2h,扩环反应2.5h;酸析pH值为2.0,收率为。85%以上。该条件有效地减少了BSU制造步骤,并降低了BSU的用量,大幅度地降低了7-ADCA的生产成本。同时制得7-苯乙酰氨基脱乙酰氧基头孢烷酸的纯度>95%,可直接用于下一步的裂解,并对酶的影响很小。
  • [资讯] 治疗结膜炎的新喹诺酮类药物贝西沙星
    摘要:贝西沙星(besifloxacin)是由美国博士伦(Bausch & Lomb)公司开发的一种新的用于治疗结膜炎的喹诺酮类抗菌剂,其化学名为7-[(3R)-3-aminohexa-hydro-1H-azepin-1-y1]-8-chloro-1-cyclopro-py1-6-fluoro-1,4-dihydr04-oxo-3-quinolinecar-boxylicacid(结构式见图1),分子式C19H21CIFN3O3,相对分子质量为393.85。贝西沙星盐酸盐(商品名Besiv-ance),分子式C19Gh21CIFN3O3·HCl,相对分子质量430.30,其剂型为混悬滴眼剂。贝西沙星通过作用于C+和G-细菌的DNA回旋酶和拓扑异构酶IV,干扰细菌DNA的合成,对于易引发结膜炎的G+和G-菌、厌氧菌具有良好的抗菌效果。同时,贝西沙星能够显著抑制眼部致炎因子的表达,发挥局部免疫调节的作用,2009年5月28日获得美国FDA批准,用于细菌性结膜炎的治疗。现对其药理作用、药动学、临床试验等进行简要介绍。 1药理作用 贝西沙星对棒状杆菌G、假白喉棒状杆菌、纹带棒状杆菌、流感嗜血杆菌、结膜炎摩拉克菌、金葡球菌、表皮葡萄球菌、路邓葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、轻型链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、唾液链球菌、沃氏葡萄球菌等数十种细菌具有抗菌活性,对于某些对喹诺酮类药物产生耐药性的菌种,也具有抗菌作用。对氨基糖苷类、大环内酯类、β-内酰胺类耐药的细菌均较为敏感。但体外试验发现,贝西沙星与其他喹诺酮类药物存在交叉耐药。该药最低杀菌浓度稀释1倍即为其最低抑菌浓度。 贝西沙星能够显著抑制脂多糖(LPS)诱导的人体THP-1单核细胞细胞因子的产生,其抑制活性呈现剂量依赖性特点。采用流式荧光检测技术,测定了贝西沙星对Fractalkine,G-CSF,GM-CSF,IL-12p40,IL-1a,IL-1β,IL-1ra,IL-6,IL-8,IP-10,MCP-1,MIP-1a,RANTES,VECF的抑制活性。其中,贝西沙星在0.1mg·L-1浓度下,对IL-1a即产生显著抑制效果;在10mg·L-1浓度下,对G-CSF,IL-1a,IL-1ra,IL-6可产生显著的抑制效果;在30mg·L-1浓度下,对G-CSF.IL-1α,IL-1ra,IL-6,VEGF可产生显著的抑制效果;在30mg·L-1浓度下,对G-CSF,GM-CSF,IL-12p40,IL-la,IL-1β,1IL-1ra,IL-6,IL-8,IP-10,MCP-1,MIP-la,VEGF可产生显著的抑制效果。在上述4个浓度条件下,贝西沙星对Fractalkine和RANTES均不产生抑制作用。与莫西沙星相比,贝西沙星对G-CSF,IL-1β,IL-1ra,IL-6的抑制活性优于莫西沙星,对GM-CSF,IL-1β,IL-8,IP-10,MCP-1,MIP-1a的抑制活性与莫西沙星相当。贝西沙星能够显著抑制IL-1β诱导的角膜上皮细胞中细胞因子的表达。采用流式荧光检测技术,测定了贝西沙星对12种细胞因子的抑制效果。以莫西沙星为参照,贝西沙星对G-CSF,GM-CSF,IL-6,MCP-1,MIP-1β,TGF-a和TNF-a的抑制活性优于莫西沙星,对IL-8的抑制活性与莫西沙星相当。贝西沙星能够抑制IKB的降解、NFKB的核转运以及p38和JNKMAPKs的激活。 2药动学 0.6%贝西沙星眼用混悬剂局部点眼,在家免和短尾猴眼内具有很好的通透性,其药效浓度在眼前角组织中维持时间达到24h以上。经测定,贝西沙星在家兔和短尾猴的结膜、角膜、房水中的Cmax分别为6μg·g-1,2.10μg·g-1,0.796μg·mg-1,消除半衰期在4-12h之间,在人体的Cmax是610μg·g-1,24h后浓度降低至1.6μg·g-1。经测定人体泪液中贝西沙星的药动学参数,对肺炎链球菌、金葡球菌、表皮葡萄球菌和流感杆菌的MIC90分别为0.125,0.25,0.5和0.06μg·g-1。对于上述泪液中存在的病原菌,经测定,Cmax/MIC90≥1220,AUC0-24/MIC90≥2500。贝西沙星局部滴眼(tid),其在血液中的Cmax低于0.5μg·ML-1 3临床评价 一项细菌性结膜炎患者参加的随机、多中心、双盲、安慰剂对照III期临床试验考察了贝西沙星的临床有效性和细菌消除率。患者随机分组,tid给药,治疗周期5d。治疗5-6d为第一个测定时间点,8-9d为第二个测定时间点。第一测定时间点,贝西沙星和安慰剂对照药比较,临床有效率分别是45.2%,33.0%(P=0.0084),细菌浦除率分别是91.5%,59.7%(P<0.0001);第二测定时间点,临床有效率分别是84.4%,69.1%(P=0.0011),细菌清除率分别是88.4%,71.7%(P<0.0001),临床不良反应发生率分别是9.2%,13.9%(P=0.0047)。 一项269例急性细菌性结膜炎患者参加的随机、前瞻性、多中心、双盲、安慰剂对照、平行临床试验,考察了贝西沙星的细菌消除率。患者随机分组,tid给药,治疗周期5d。治疗4d后,为第一个测定时间点,8d为第二个测定时间点。第二测定时间点,贝西沙星和安慰剂对照药比较,细菌清除率分别是88.3%,60.3%(P<0.0001)。 一项1161例试验者(533例细菌性结膜炎患者)参加的多中心、随机、双盲、平行、对照药(莫西沙星)临床试验考察了贝西沙星与莫西沙星的临床治疗效果比较。患者随机分组,tid给药,治疗周期5d。治疗5d为第一个测定时间点,治疗8d为第二个测定时间点。贝西沙星和对照药莫西沙星基于两种药差异95%可信区间比较,第一时间点测定,贝西沙星和莫西沙星的临床有效率分别是58.3%,59.4%,细菌清除率分别是93.3%,91.1%.其95%可信区间分别是-9.48-7.29,-2.44-6.74;第二时间点测定,贝西沙星和莫西沙星的临床有效率分别是84.5%,84.0%,细菌清除率分别是87.3%,84.7%,其95%可信区间分别是-5.6-6.75.-3.32-8.53。 4安全性和禁忌 临床试验显示,贝西沙星临床不良反应累计发生率分别是50.4%,53.0%,其中,最常见的不良反应眼部疼痛发生率分别为10.5%.6.9%,视力模糊发生率分别是10.5%,11.7%,眼涩发生率分别是7.4%,12.2%。贝西沙星与莫西沙星临床试验比较,两种药的临床不良反应发生率分别是12%,14%,用药后发生眼部刺激概率分别是0.3%,1.4%,贝西沙星用药后发生眼部刺激不良反应的概率远低于莫西沙星。贝西沙星最常见的不良反应是结膜炎性眼红,发生率约为2%。在治疗期间,患者应避免佩戴隐形眼镜。过度使用贝西沙星,易引发非敏感菌的滋生、繁殖,一旦发生由于过度使用该药导致的耐药菌二次感染,应立即停药,变更治疗方案。 5剂型、规格、用法与用量 该药常用剂型为0.6%贝西沙星的混悬滴眼剂,规格为5mL,在15℃-25℃条件下,避光保存。q4-12h,每次1滴,7d内使用,开封后易滋生细菌,故不能久置后使用。 6结语 贝西沙星在治疗结膜炎方面,对于易引发结膜炎的大多数C+菌和G-菌及厌氧菌具有良好的抗菌作用,对于某些对喹诸酮类药物产生耐药性的菌种,同样具有抗菌作用;同时,能够显著抑制眼部致炎因子的表达,发挥局部免疫调节的作用;局部滴眼,眼部各组织具有良好的药动学特征。因此,贝西沙星与现有上市的治疗结膜炎喹诺酮类药品相比,更有发展前景,该药的成功上市必将推动新喹诺酮类药物市场的发展,同时给患者带来了福音。
  • [资讯] 促进我国创新药研发关键技术要素的探讨
    摘要:创新药研发反映了国家和制药企业的综合实力,提高创新药研发能力是一项复杂、艰巨和长期的工作,需要遵循创新药研发的客观规律,才能取得成功。本文就目前我国的药品研发和申报的现状进行分析,找出我国制药企业在创新研发中存在的不足,探索促进我国创新药研发能力提高的关键要素。 1 国内药品研发申报的现状及分析2004年1月1日2007年12月31日之间国家食品药品监督管理局(SFDA)受理并转入势品审评中心(CDE)进行技术审评的化学药品注册申报数据进行统计,并对属创新药、新药、改剂型和仿制的审评任务进行分类,具体结果见表1。 从上述数据进行分析,在2004-2007年间,化药每年的申报量较大,2005年达高峰为超过1.5万件。创新药申报数量占总体申报量的比例2004年0.2%,2005年0.8%,2006年1.0%,2007年1.9%。创新药的申报呈逐年上升趋势。 结果显示:仿制药仍是目前我国制药企业研制和申报的主要品种,但对2005-2008年的创新药申报企业进行分析,国内已有90家企业进行创新药的研制和申报,从研发规模到涉及的适应症范围均。明显拓展,此现象说明了我国的部分制药企业已开始涉足创新药研发领域,因此,国内目前已呈现由仿制药研发为主的制药模式转向仿创结合的模式。 2 目前在我国创新药研发中存在的主要问题 由于我国制药企业进行创新研发的时间不长,经验不丰富,结合审评实践,我们发现存在一些不足。 2.1 对创新研发的风险意识不足 由于我国长期以来主要以仿制药研发为主,制药企业已经习惯用仿制药研发的思路去对待创新药的研发。对于仿制药而言,研发的关键问题是一致性,研究工作相对有标准可循。只要在药学方面研究深入,工作完善,获得批准上市的成功率非常高。而创新药研发则完全不同,从分子开始并不成其为药品,只有通过大量研究确定药物的特性,并确证其安全有效之后才能获得上市。从国外大量研究资料表明,1万个候选化合物进行非临床研究和临床试验,最终仅有1个能真正成为药品上市,因此,创新药研发的风险远远大于仿制药。 为减少风险,国外跨国公司在研发创新药时,通常会建立一个序列研究通道(pipeline),即制定公司整体研发策略,对多个药物进行研发,根据获碍成功的几率排序推进,将有限的人力、资金最合理地利用。而我国的制药企业相对资金和人力资源不如跨国企业,通常一个企业只有一个或不多的2-3个药物在研,因此,我们就会害怕失败,也禁不起失败,在研发过程中,我们通常会不顾研究结果如何,都必须向前推进,导致完成Ⅲ期临床试验后,没有充分的数据支持上市,不能获得批准,造成时间和资金的巨大浪费。 2.2 未建立创新研发的整体策略 创新药的临床试验是一个循序渐进的过程,从确定第一个用于人体试验的初始剂量、确定药物在人体的最大耐受剂量和药动学参数、了解剂量效应关系、探索合适的用法用量,直到在大规模的人群中进行临床试验确证安全有效性,一切的研究应是系统和有序的进行,制药企业需要对每一个药物盼研发从一开始就有一个整体的规划,包含什么时间开始进行什么试验,这个试验能解决什么问题,获得研究结果后什么结果支持下一步研究,什么结果说明不值得继续研究,什么情况下还需进行另外一个试验获得更多数据或验证结果。所有的研究需要从整体上进行规划,而不是按照法规规定的最低病例数去完成简单的各期研究。 2.3 研发团队中相关专业人员缺失 创新药研发是个极为综合的研究过程,需要从药学、药效学、非临床安全性评价、药动学、临床药理学、临床医生、统计学、数据管理等多个学科的参与,发现好的临床使用价值才是创新药真正的价值和利益所在。由于我国既往以仿制药研发为主,制药企业中绝大多数研究人员为药学方面的专业背景,专业单一的研发团队很难适应创新药研发整体推进的要求。 2.4 缺乏与相关机构的有效沟通 与仿制药研发相对固定模式不同,创新药研发针对不同疾病、不同人群,对药物评价的标准和要求有所不同,对其风险和利益的权衡的标准也不同,有的药物可能需要很少的病例数和研究结果就足以支持上市使用,而有的药物则需要远大于法规要求的最低病例数才能满足评价需要,因此,研究者和评价者在研究之前、研究过程中需要进行沟通,确定统一原则和标准,便于对研究结果进行评价。沟通在创新药研发中显得十分重要。 3 促进我国创新研发的关键要素 鉴于我们在创新研发中的不足,本文提出以下几个促进创新能力提高的与研发相关的关键技术要素。 3.1 增强责任意识,提高风险意识 创新药研发的责任主体是制药企业。我国的制药企业多年来在仿制药的研发中形成了只负责药学方面的工作经验。创新药研发涉及的学科领域、相关单位比较多,包括非临床研究单位、临床研究机构、伦理委员会、统计学和数据管理部门、合同研究组织(CRO)以及评价机构等,在创新药研发过程中,企业应担负起责任主体的职责,负责管理、协调以及监查相关单位、人员的工作,保证创新药研发的整体质量,而不是只将相关工作交由其他单位,一旦出现问题互相指责,挫伤创新积极性,影响创新研发的推进。 同时,企业还需要提高风险意识,创新药研究是一个不断发现和淘汰的过程,尤其进入人体研究,费用会成倍上翻,因此,需要建立尽快、尽早淘汰无效或不安全的候选药物的理念,将时间和资金投入有前景的药物。 3.2 建立以临床需要为导向,基于问题进行研发的整体研发策略 创新药研究的科学目的是解决尚未解决的医学问题,只有基于这样的研发,创新药之创新才有实际意义。目前一些制药企业利用新的技术进行创新,但创新的产品与已上市产品相比,优势并不突出,这样的创新价值就不大。因此,在选择创新方向时,一定以临床需要为目标,这样的创新药利益空间才比较大。 创新药研发是通过一系列研究使未知变成知道,将假设变成确证,创新药的每个临床试验都是在回答一个问题,通过研究的推进,使我们对创新药的特点更加了解,对于采用何种剂量和方案用于何种患者,能取得怎样的疗效和可能承担的风险有明确的界定和准确的把握,这样才能去权衡其风险和利益,才能评价是否可以上市使用。因此,需要从回答问题的角度着手制定研发整体研发计划,明确每个阶段需要回答的问题。并且,还需要制定研发终止的标准,这一点十分重要。 3.2.1 重视研究方案的制定研发方案是研究的基础。在目前的创新药研究中,我们也发现无论是临床前的研究还是临床试验,对方案的重视程度不够,很多研究在完成之后,才发现研究设计不合理,导致研究结果无法评价。这是十分可惜的事情。在研究前制定科学合理的规则和标准,严格按照规则去执行,按照既定的标准去评价,这样的研究结果才可信可靠,研究才更有效。 3.2.2 研究工作分阶段进行在整体研发计划制定中,需要考虑研究工作的合理安排和步骤,分阶段进行,比如在申请I期临床试验前,动物毒性研究的时间仅需满足对I期临床试验方案用药疗程的评价,长期毒性研究工作可继续进行,但不必等待其完成了才计划进行I期临床试验。同时,还需要明确哪些是关键性试验,哪些是非关键性试验,对于关键性试验,必须按计划进行并明确推进和终止的标准,对于非关键性试验,主要为上市说明书提供更多信息,而非作为支持药物安全有效性的上市依据,这样的试验可放在关键试验之后进行。 3.2.3 采用新技术提高研发效率创新药研发的过程是探索、学习和确证的过程,前期的工作都是用于为后期的确证性临床研究提供支持数据,提高后期成功的把握度,因此,前期工作对后期结果的预测性十分重要,是提高成功率的关键。近年来,许多跨国公司为了降低后期临床试验失败的风险,提高药物上市的成功率,他们将生物标记物(biomarks)、建模和模拟技术(modeling and stimulation)和适应性临床研究设计(adaptive design)等一些新的技术和研究方法引入创新药研发中,也是我们可以借鉴的经验。 3.3 建立与创薪药研发相匹配的研发团队 由于创新药研发的系统性、全面性,涉及的学科专业多,因此,需要建立专业完善的创新药研发团队,除了药学人员以外,医学、统计和数据管理人员也十分重要,甚至还需要项目管理、法律方面的人员。基于我国目前现状,制药企业不能在短期内形成如此庞大的研究团队,但企业可以有意识地发挥好我国大专院校、研究机构和医院中已有的人才,在创新研发中多听取各方面的意见和建议。 3.4 加强有效的沟通和交流。 创新药研发没有固定模式,无论在研究设计、指标选择还是在结果分析方面,都有许多需要研究和讨论之处。其中,制药企业、研究者和管理机构进行交流显得十分重要。美国FDA在创新药管理体系中,设立了专门的沟通交流会议途径,通过在创新药研发的不同阶段、采用不同方式和途径进行交流。对于我国的创新药研发而言,鼓励沟通和交流更是必须的,但前提是建立负责任的沟通交流模式。制药企业作为创新药研发主体,需要对研发的整体计划和研究步骤进行深入和全面的考虑,通过严谨、科学的研究推进创新药研发进程,在与评价机构的沟通中,提出自己的方案并讨论是否可行;而评价机构也需要本着科学、开放的态度,与制药企业就面临的问题进行充分讨论,使其了解评价尺度、技术要求,通过实际的指导引导创新。
  • [资讯] (上)310.15K时蛋白质模型化合物与二元醇在水溶液中的异系焓相互作用
    摘要:二元醇是-类特殊的有机化合物,它可以增强球状蛋白的热稳定性,也可以通过其它方式来降低。变性程度,虽然在生物有机体细胞和细胞外都未被发现,但它们在药品和化妆品行业中已有广泛的应用。当它们被作为一种医药品和化妆品的媒介被引入生物体中时,它们就影响了细胞中物质的成分,其作用已经在二元醇和生物细胞的大量研究中被证实,所以,探索二元醇与蛋白质在水溶液中的作用本质是非常有意义的。由于蛋白质的结构非常复杂,很难直接以蛋白质为研究对象来研究它在水溶液中与二元醇作用的本质,因此,必须从研究简单的蛋白质模型化合物人手来探索二元醇对蛋白质结构的影响,氨基酸是重要的生物活性物质,是组成蛋白质的基本结构单位。N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和N,N-二甲基乙酰胺(DMA)是用途极广的化工原料,由于DMF和DIVIA似肽结构和-CH3的存在常被认为是模拟多肽和蛋白质分子内部环境的模型化合物,所以,以氨基酸、肽、酰胺及其衍生物作为蛋白质模型分子来探讨复杂溶液中两性离子与共溶剂及共溶质的相互作用的溶液热力学是很有意义的。 为深入了解蛋白质和多肽链在复杂溶液中的物理化学现象,在我们的前期工作中,主要偏重于研究298.15K时蛋白质模型化合物在水溶液及混合水溶液(乙二醇、丙三醇、丙二醇等)中的热力学性质,其它温度的相关研究少见报道,为了进一步完善蛋白质模型分子体系溶液热力学性质的研究,本文在前期研究的基础上进一步选取新的研究体系和温度,测量蛋白质模型化合物(甘氨酸、丙氨酸(全文均为L-丙氨酸)、DMF和DMA)与二元醇(1,3-丁二醇和2,3-丁二醇)在水溶液中的混合焓和稀释焓,并根据McMillan-Mayer理论计算出水溶液中蛋白质模型化合物与二元醇相互作用的各级异系焓相互作用系数,来探讨溶质一溶质分子间相互作用的机制,由于310.15K接近人体的平常温度,对该温度下的蛋白质模型化合物热力学性质的探索,可以为生物化学和医药化学的研究提供更多的信息。 1 实验部分 1.1 试剂与仪器 氨基酸(生化级,中国医药(集团)上海化学试剂公司(进口分装))置于真空硅胶干燥箱内48h后使用。DMF、DMA、1,3-丁二醇和2,3-丁二醇(分析纯,中国医药(集团)上海化学试剂公司)经减压精馏精制后使用。2277精密热活性检测仪(瑞典AB公司,测量精度(300μW量程)为±0.2%,恒温精度为±0.0002K),LKB-2132微蠕动泵,Mettler AE200型电子天平(误差为±0.0001g)。水为新制备的二次重蒸水。 1.2 实验方法 混合过程的焓变、稀释焓用2277精密热活性检测仪的流动混合系统测定.实验温度为310.15K.不同质量摩尔浓度的溶液用称量法配制,所配溶液均在12h内使用,当量热计恒温水浴和检测系统达到热平衡后,用溶剂水设定基线并进行电标定。设备具体使用和测量方法已在前期工作中详细阐述。 1.3 数据处理 根据McMillan-Mayer理论,利用测量得到的混合焓和稀释焓计算出各级异系焓相互作用系数,在恒定温度和压强下,含两种不同溶质x和y的三元水溶液过量焓HE(mx,my)可以表示为质量摩尔浓度的维里展开形式: HE(mx,xy)/w1=H(mx,my)/w1-hw*-mxHx,m-myHy,m =hxxmx2+2hxymxmy+hyymy2+hxxxmx3+3hxxymx2my+3hxyymxmy2+hyyymy3+… (1) 式中HE(mx,my)/w1表示由质量摩尔浓度为mx的溶质x,质量摩尔浓度为my的溶质y所组成的溶液在水(质量为w1)中的过量焓;H(mx,my)表示1kg溶剂水的总焓;hw*为纯水的绝对焓;Hx,m和Hy,m分别为溶质x和y的极限偏摩尔焓;hxx,hyy,hxy和hxxx,hxxy,hxyy,hyyy分别为焓对和焓叁作用系数。 以每kg溶剂水计的溶质(x或y)的稀释焓△Hdil(J·kg-1)可按下式计算: △Hdil=P/(fA+fB-mx,iMxfA) (2) 式中P为溶质的稀释热功率,mx,i为稀释前溶液的质量摩尔浓度,fA为溶液的流速,fB为溶剂水的流速,Mx为溶质x的摩尔质量。 稀释后溶液的质量摩尔浓度mx mx=mx,ifA/[fB(mx,iMx+l)+fA] (3) 以每kg溶剂水计的溶质x的溶液和溶质y的溶液的混合过程焓变△Hmix(J.kg-1)按下式计算: △Hmix=P*/(fx+fy-mx,iMxfx-my,iMyfy) (4) 式中P*为混合过程热功率,fx和fy分别为溶质x和溶质y的流速,mx,i,my,i分别为这两种溶液混合前的质量摩尔浓度,Mx,My分别为溶质x,y的摩尔质量。 定义一个辅助函数△H* △H*=△Hmix-△Hdil(x)-△Hdil(y) =HE(mx,my)-HE(mx)-HE(my) (5) 由方程(1-5)可得: △H*/w1=2hxymxmy+3hxxymx2my+3hxyymxmy2+… (6) 将多组不同的mx和my值的实验结果带入上式进行计算,就可以得到焓对和焓叁相互作用系数。
  • [资讯] (上)氟喹诺酮类抗菌药物抗结核作用研究进展
    摘要:结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(M.tuberculosis,MTB)引起的严重危害人类健康的重大传染病之一。从20世纪80年代开始,耐药TB.尤其是耐多药TB(multi-drug resistant TB,MDR-TB)的发病率不断上升以及TB与HIV/AIDS相结合使TB疫情再度上升,成为全球关注的重大公共卫生问题和社会问题。遗憾的是,近40余年来几乎没有新作用机制的抗TB药物上市,传统的抗TB药物,如异烟肼(isoniazid,INH)、利福平(rifampin,RIP)、链霉素(streptomycin,SM)、乙胺丁醇(etham-butol,EMB)和吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)等联合用药可使85%以上的初治肺结核(pulmonary TB,PTB)患者痊愈,但存在治疗周期长(大于6个月)且对MDR-TB无效的缺点,同时对潜伏态MTB的作用不强,因此研发抗TB新药,实现对TB的有效治疗与控制迫在眉睫。世界卫生组织(WHO)于1996年推出的耐药TB处理指南明确把氟喹诺酮类抗菌药,如环丙沙星(ciproflloxacin,CPFX)、氧氟沙星(ofloxacin,OFLX)和司帕沙星(sparfloxacin,SPFX)等作为二线抗TB药物,与其他抗TB药物联合使用治疗MDR-TB及对不能耐受一线抗TB药物的患者使用。经过10余年临床实践的检验,这类药物的抗结核疗效已获得普遍肯定,但由于广泛使用以及不合理用药,MTB已对该类药物出现耐药性,其中在某些国家或地区特别严重。1项调查结果表明,在菲律宾的马卡迪城,敏感性MTB对CPFX和OFLX的耐药率为26%-35%,而耐药性MTB对这2种氟喹诺酮类抗菌药的耐药率则高达50%以上。随着氟喹诺酮类抗菌药的迅速发展,更具特点的新品种不断问世,其抗菌活性和药动学性质明显改善,某些品种的抗结核活性也显著增强。如8-甲氧基氟喹诺酮莫西沙星(moxifloxacin,MXFX)和加替沙星(gatifloxacin,GTFX)的体内活性堪与INH(活性最强的一线抗TB药物)媲美,而用MXFX替代标准治疗方案中的INH,其疗程可缩短2个月。然而由于伦理学等原因,氟喹诺酮类抗菌药物同传统抗TB药物一样也无法进行单药的现代临床试验,因此其抗结核作用的基础研究在指导临床医师合理用荮等方面就显得尤为重要。本文从作用机制和耐药机制、构效关系(SAR)、药动学性质和临床基础研究(早期杀菌活性)以及单药和联合用药时的体内外活性等方面较全面地综述了近年来氟喹诺酮类抗菌药抗结核作用研究进展。 1 作用机制和耐药机制 1.1 作用机制 氟喹诺酮对大多数G-菌的主要作用靶点是DNA促旋酶(又称拓扑异构酶II),该酶是细菌DNA复制、转录和修复所必需的酶,它是分别由gyrA和gyrB基因编码的2个A亚基和2个B亚基组成的四聚体(A2B2),其中A亚基负责DNA染色体的断裂和重接,B亚基负责ATP水解过程中的能量转移。氟喹诺酮对许多G+菌的主要作用靶点是拓扑异构酶Ⅳ,此酶的2个亚基分别由parC和parE基因编码(在金葡球菌中则由grlA和grlB基因编码),parC和parE分别与gyrA和gyrB具有高度同源性。分子生物学研究结果显示,MTB中的DNA促旋酶与细菌中的DNA促旋酶非常相似,其A亚基和B亚基也分别由gyrA和gyrB基因编码,但在其基因组中不存在拓扑异构酶IV的parC和parE基因同系物,故DNA促旋酶被认为是氟喹诺酮对MTB的惟一作用靶酶。这类药物对分枝杆菌的作用机制也与其抗菌(如大肠埃希菌)机制相似,即通过抑制双链DNA三元复合物而快速杀死细菌。 1.2 耐药机制 相关研究结果表明,DNA促旋酶中gyrA基因突变,特别是该基因中90和94位密码子的突变可能是MTB对多数氟喹诺酮类药物产生耐药的主要原因,而对具有高度抗MTB活性的氟喹诺酮(如SPFX)产生耐药则需要gyrA和gyrB基因同时突变。此外,也可能存在其他耐药机制,如细胞膜渗透性降低和药物主动外排等。 令人欣慰的是,MTB对氟喹诺酮类药物的自发突变率很低(1×10-6-1×10-8),且它们与其他抗TB药物(如INH和RIP等)之间罕见交叉耐药性。然而,如同G-菌和G+菌一样,MTB在这类药物之间也普遍存在交叉耐药性,如MTB对CPFX,OFLX或左氧氟沙星(levofloxacin,LVFX)之一耐药时,它同样也对另外2种药物耐药。又如采用OFLX+SM+INH治疗PTB45d时,临床分离的MTB对OFLX耐药,而治疗5个月后的临床分离MTB对CPFX和SPFX也耐药(尽管患者从未接受过CPFX和SPFX治疗)。总之,不合理的联合治疗方案或单一给药方案往往是使氟喹诺酮类药物获得临床耐药性的主要途径。 2 构效关系 在具有优秀抗G+菌(尤其是肺炎球菌)活性的氟喹诺酮类抗菌药中,SPFX,MXFX和GTFX也同时具有优秀的抗结核活性,而吉米沙星(gemifloxacin,GMFX)和曲伐沙星(trovafloxacin,QVFX)仅具有较弱的抗结核活性。在具有明显抗G-菌活性的早期氟喹诺酮类抗菌药中,诺氟沙星(norfloxacin,NFLX)、培氟沙星(pefloxacin,PFLX)和氟罗沙星(fleroxacin,FLSX)等的抗分枝杆菌活性很弱,而CPFX和OFLX则具有中等强度的抗分枝杆菌活性。此外,具有优秀抗菌活性的萘啶酮类药物,如GMFX、QVFX和托氟沙星(tosufloxacin,TSFX)等的抗分枝杆菌活性均较弱,故萘啶酮母核似乎是抗结核活性的不利结构因素,这一结论已经为定量构效关系(QSAR)研究所证明。SAR研究结果表明,N-1位取代基对抗结核活性的贡献顺序为:叔丁基≥环丙基>2,4-二氟苯基>乙基≈环丁基>异丙基。7-位取代基是决定氟喹诺酮类抗菌药抗结核活性及其药动学性质的关键结构片段,鉴于7-(取代)哌嗪基与7-(取代)吡咯烷基(最常见的2类取代基)氟喹诺酮类抗菌药的抗结核活性相似,故其结构改造主要集中在以下3个方面:①向7-位取代基中引入其他具有适宜亲脂性的基团以克服分枝杆菌的转运屏障,如向CPFX/GTFX7-位哌嗪基/3-甲基哌嗪基中的4-位氮原子上引入取代吲哚满二酮-1-甲基后得到的一系列衍生物对分枝杆菌的体外活性普遍明显优于相应的母药。②通过连接基团将不同作用机制的其他抗结核化合物与氟喹诺酮相连无疑仍是寻找抗结核新药的有效手段之一,如一线抗TB药INH和PZA或其他具有较强抗结核活性的化合物(如8-羟基喹啉)通过不同基团连接于氟喹诺酮7-位取代基的氮原子上,得到的衍生物具有明显的抗结核活性。③使具有抗结核活性的氟喹诺酮分子与巨噬细胞受体的特定配体相结合形成靶向前药,直接进入感染的巨噬细胞来达到灭菌效果。如通过化学方法将MXFX和丹(磺)酰戊二胺与羧甲基葡聚糖(巨噬细胞清道夫受体的一种已知配体)相结合或通过右旋糖酐(dextran,载体)和四肽将NFLX(体内无抗分枝杆菌活性)与甘露糖(mannose,配体)结合所形成的活性靶向复合物前药在巨噬细胞中的累积要有效得多,其体内活性也明显优于相应的母药。8-位取代基对氟喹诺酮类抗菌药抗结核活性的贡献取决于N-1位上的取代基:①N-1位为环丙基时的活性顺序为:COMe≈CBr>CCI>CH≈CF≈COEt>N>CCF3。②N-1位为2,4-二氟苯基时的活性顺序为:N≈CH>CF>COMe。③N-1位为叔丁基时的活性顺序为:N≥CH。④N-1位为乙基时的活性顺序为:N>CH。总之,通过对氟喹诺酮1,7和8-位取代基的结构改造,已发现和筛选出若干个有苗头的新化合物。 3 抗结核活性 3.1 体外活性 3.1.1单药体外活性 在研究较多的5种氟喹诺酮抗TB药物中,GTFX和MXFX对MTB的体外活性最强(MIC分别为0.125和0.177mg·L-1),其次是LVFX(MIC为0.355mg·L-1),CPFX和OFLX最弱(MIC分别为0.500和0.707mg·L-1),而SPFX的活性(MIC为0.125-0.500mg·L-1]与MXFX(MIC为0.12-0.50mg·L-1)相当。此外,MXFX对其他分支杆菌(如堪萨斯分支杆菌等)也具有活性,而且被认为是氟喹诺酮类药物中惟一对鸟分枝杆菌复合体(M.avium complex,MAC)有明显抑制作用的药物,其对胞内MAC的MIC90值为2μg·mL-1 Hu等利用3种体外模型对MXFX抗结核活性的评价结果显示,本品不仅对生长缓慢的MTB具有明确的杀菌活性,而且对耐受高浓度RIP的持留菌也表现出有效的杀菌活性。提示MXFX可能具有缩短耐药TB疗程的潜力。 Freites等评价了LVFX,GTFX和MXFX对23株临床分离MTB(其中4株对INH或PZA耐药,1株对INH和RIP均耐药)的体外活性。结果显示,这3种氟喹诺酮类抗菌药对MTB均具有较强的抗MTB活性,其中GTFX的活性(MIC90为0.031mg·L-1)优于LVFX和MXFX(二者的MIC90分别为1和0.125mg·L-1)。 Serraano等评价和比较了6种氟喹诺酮类抗菌药对250株临床分离MTB的体外活性,结果表明:①CPFX,LVFX和革帕沙星(grepafloxacin.GPFX)的活性最强(MIC90为1μg·mL-1),其次是OFLX(MIC。。为2μg·mL-1),QVFX和GMFX的活性最弱(二者MIC90分别为64和8μg·mL-1)。②虽然LVFX和GMFX对敏感株(206株)的MIC90与耐药株(44株)相当,但二者对敏感株的MIC的几何平均值小于相应的耐药株,其余4个化合物对敏感株的活性均为耐药株的2倍。③MTB对所试验的6种氟喹诺酮类抗菌药药物存在交叉耐药性。④耐药株对一线药物的耐药水平与氟喹诺酮类抗菌药抗MTB活性无关。

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