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  • [资讯] 抗菌肽产生菌侧孢短芽孢杆菌高产菌选育
    侧孢短芽孢杆菌是既能抗菌、杀虫又有医用价值的微生物资源,具有多种生物学活性及广谱抗菌活性,尤其是对细菌和真菌。国外文献报道较多的抗菌物质有肽类抗生素、非肽类的芽孢菌胺、几丁质酶以及聚酮化合物等。其中抗菌肽是一类具有高效、广谱抗菌活性的小分子碱性多肽,耐热性、pH 值稳定性、储藏稳定性好,具有无毒副作用、无残留、无耐药性等特点。同时,抗菌肽对畜禽具有促生长、保健和治疗疾病的功能,在作为无公害饲料添加剂、药物等方面具有巨大的潜在应用前景。 等离子体诱变技术是通过对细胞有影响的荷电粒子、光、中性粒子等离子体对生物遗传物质及表层造成损伤,引起细胞自我修复,从而导致生物体基因的改变。等离子体诱变技术可以较大程度地提高诱变效率,提高细胞存活率,是一种适合于微生物诱变育种的技术。 由于实验室保存的侧孢短芽孢杆菌产抗菌肽菌株发酵单位偏低,为提高产抗菌肽菌株的产量,作者采用对数生长期的菌体作为诱变对象,利用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术筛选抗菌肽高产菌株,以降低生产成本,为工业化生产奠定基础。 1 实验 1.1 菌株、培养基与仪器 侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)KT-06,本实验室保存。 斜面及固体培养基(LB):胰蛋白胨1%,酵母粉0.5%,NaCl 1%,琼脂1.5%~2.0%,pH 值调至7.2~7.4,121℃下灭菌20min。 种子培养基:胰蛋白胨1%,酵母粉0.5%,NaCl 1%,pH 值调至7.2~7.4,121℃下灭菌20min。 发酵培养基:葡萄糖2%,玉米浆0.5%,酵母粉0.5%,CaCl20.15%,ZnCl20.005%,pH 值调至7.2~7.4,121℃下灭菌30min。 营养琼脂培养基:胰蛋白胨0.6%,牛肉浸膏0.15%,酵母浸出粉0.6%,葡萄糖0.1%,KHPO0.2%,KHPO0.8%,琼脂1.5%~2.0%,pH 值调至6.0,121℃下灭菌20min。 ARTP-ⅡS型诱变育种仪,无锡源清天木生物科技有限公司;LC-2030C型高效液相色谱仪,岛津。 1.2 方法 1.2.1 菌悬液的制备 将侧孢短芽孢杆菌KT-06斜面菌种挖块(0.5cm×1.0cm)接种于种子培养基(40mL/250mL三角瓶)中,37 ℃、200r·min-1振荡培养6~10h;取2mL加入6mL无菌生理盐水中,菌悬液浓度达到107CFU·mL-1 1.2.2 ARTP诱变 取10μL菌悬液滴加在无菌不锈钢载片上,将载片置于诱变育种仪中,按设计时间进行照射;然后将载片投入装有1.5mL无菌生理盐水的EP管中,振荡洗涤,混匀,稀释菌悬液后分离涂布到LB培养基平板上,37℃暗培养3d,计数。 1.2.3 摇瓶培养 挖块(0.5cm×1.0cm)斜面培养成熟菌种,接种于种子培养基(40mL/250mL三角瓶)中,37℃、200r·min-1振荡培养12~16h,以5%的接种量接种到发酵培养基(40mL/250mL三角瓶)中,37℃、200r·min-1振荡培养25~30h。 1.2.4 发酵液抑菌活性的测定 抗菌肽抑菌活性的测定采用琼脂扩散法。以藤黄八叠菌CMCC 28001为指示菌,用无菌生理盐水将其稀释到107 CFU·mL-1。将100mL营养琼脂培养基倒入直径195mm 平皿中,冷却凝固;取0.2mL指示菌菌悬液置于100mL冷却至50~60℃的营养琼脂培养基中,混匀倒板,冷却凝固。适当位置放置牛津杯,向牛津杯中加入300μL离心发酵液,置于37℃培养箱中培养16h,用游标卡尺测量透明圈直径(mm)。 1.2.5 发酵液HPLC分析条件 取发酵液2mL,100℃ 水浴20min,13 000r·min-1离心12min,取上清液,进行HPLC分析。 HPLC条件:C18柱(4.0mm×250mm,5μm);A相1‰三氟乙酸,B相纯乙腈,梯度洗脱(条件见表1);检测波长200nm,进样温度35℃,进样量15μL,进样流速1mL·min-1;tR7.28min,tC15min。 2 结果与讨论 2.1 ARTP诱变剂量(处理时间)的选择 在LB培养基平板上涂布经ARTP诱变处理不同时间的菌悬液,37℃培养3d,以未诱变处理的菌悬液作为对照,计算致死率;摇瓶筛选ARTP诱变处理不同时间的菌落,计算突变率,结果见表2。 由表2可知,随着ARTP诱变处理时间的延长,致死率逐渐升高;ARTP诱变处理90s时,正突变率最高。因此,确定最佳ARTP诱变处理时间为90s。 2.2 突变株摇瓶筛选 采用最佳诱变剂量对菌悬液进行ARTP诱变。第一轮ARTP诱变处理,摇瓶初筛菌株共计212株,获得36株发酵单位提高20%以上菌株;复筛3批后,获得高产菌株KT-3-15,比KT-06产量提高25.5%。进一步对菌株KT-3-15进行ARTP诱变处理,摇瓶初筛菌株共计236株,获得43株发酵单位提高20%以上菌株;复筛3批后,获得高产菌株KT-4-128,比KT-3-15产量提高33.5%,比出发菌株KT-06产量提高67.5%。 2.3 菌种选育系谱图 2.4 高产菌传代稳定性实验 菌种传代稳定性是决定菌种能否工业化生产的关键。采用斜面传代、摇瓶验证的方法,考察新菌株的传代稳定性。连续传代4次,摇瓶验证结果见表3。 3可知,连续传代4次,相对发酵转化率稳定,表明新菌株遗传特征稳定,适合工业化生产。 3 结论 以抗菌肽产生菌侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)KT-06为出发菌株,进行两轮ARTP诱变处理,获得一株具有稳定遗传性的高产菌株KT-4-128,该菌株发酵水平比出发菌株提高了67.5%。表明ARTP技术可有效应用于侧孢短芽孢杆菌的诱变选育,可大幅提高抗菌肽的发酵单位,为其工业化生产奠定了基础。
  • [资讯] HPLC-ELSD全成分指纹图谱研究疏肝理脾方配伍前后化学成分的变化
    根据中医五行理论,肝郁气滞,疏泄失常,致令运化失司,是为“木郁戕土”;脾虚失运,化源不充,肝失所藏,血不养肝,亦每令疏泄失常,是为“土虚木郁”,皆肝脾不和之证,遂有四逆散、柴胡疏肝散、逍遥散等调和肝脾之经典方药。其中柴胡疏肝散出自《景岳全书·古方八阵·散阵》,由柴胡、陈皮、枳壳、香附、芍药、川芎、甘草七味药组成。方中柴胡为君药,配伍陈皮、枳壳,起到行气解郁导滞、疏肝理脾的作用,临床常用于肝气郁结导致的胁肋疼痛等症状,也用于抑郁症、功能性消化不良、脂肪肝等疾病。本研究团队根据柴胡疏肝散的配伍规律,自拟疏肝理脾方,由柴胡、陈皮、枳壳三味药组成,研究其治疗功能性消化不良,取得较好效果,并且发现单用疏肝药柴胡或单用理气药陈皮、枳壳药理效果均不如三者合用。因此,作者利用HPLC-ELSD全成分指纹图谱研究三者配伍前后化学成分的变化,为后续药效物质基础研究提供数据支撑。 1 实验 1.1 药品、试剂与仪器 柴胡饮片(产地陕西);麸炒枳壳饮片(产地江西,生产批号为HX18M01),广东和翔制药有限公司;陈皮饮片(产地广东,生产批号为170301),佛山星联中药饮片有限公司。 柴胡皂苷a、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品(批号分别为P03M9F50593、K21F3C1、M02J9S64781、Z31J6L2067,纯度均≥98%),上海源叶生物科技有限公司;柴胡皂苷b(批号为MUST-15082505,纯度≥98%),成都曼思特生物科技有限公司;超纯水,自制;乙腈,色谱纯;其它化学试剂均为分析纯。 Nexera X2型高效液相色谱仪,日本岛津公司;ELSD 6000型蒸发光散射检测器,美国奥泰科技有限公司;DE-200g型万能粉碎机,浙江红景天工贸有限公司;实验室专用超纯水机,沃特浦;BP211D型电子分析天平,德国赛多利斯公司;TC-15型套式恒温器,海宁新华医疗器械厂。 1.2 方法 1.2.1 对照溶液的制备 取柚皮苷对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品适量,分别置于容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,分别得2.520mg·mL-1柚皮苷对照溶液、1.700mg·mL-1橙皮苷对照溶液、1.545mg·mL-1新橙皮苷对照溶液。分别精密量取上述对照溶液各2mL,置于10mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得混合对照溶液1。 取柴胡皂苷a对照品、柴胡皂苷b2对照品适量,分别置于容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,分别得1.552mg·mL-1柴胡皂苷a对照溶液、1.516mg·mL-1柴胡皂苷b2对照溶液。分别精密量取上述对照溶液各1mL,置于10mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得混合对照溶液2。 1.2.2 醋陈皮饮片的制备 取陈皮饮片适量,按0.15kg·kg-1加入米醋,拌匀,置于有盖容器中闷透,文火加热,炒至陈皮饮片内表面微黄色,取出晾凉,即得醋陈皮饮片。 1.2.3 疏肝理脾方水煎液的制备 取柴胡饮片、醋陈皮饮片、麸炒枳壳饮片,粉碎,过4号筛;称取3.00g柴胡饮片粉末、3.00g醋陈皮饮片粉末、2.25g麸炒枳壳饮片粉末,置于250mL回流瓶中,加水100mL,浸泡15min,加热回流30min,过滤;滤液移至100mL容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,即得疏肝理脾方水煎液。 1.2.4 柴胡单煎液的制备 称取柴胡饮片粉末(过4号筛)3.00g,置于250mL回流瓶中,加水100mL,浸泡15min,加热回流30min,过滤;滤液移至100mL容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,即得柴胡单煎液。 1.2.5 陈皮枳壳合煎液的制备 分别称取醋陈皮饮片粉末(过4号筛)3.00g、麸炒枳壳饮片粉末(过4号筛)2.25g,置于250mL回流瓶中,加水100mL,浸泡15min,加热回流30min,过滤;滤液移至100mL容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,即得陈皮枳壳合煎液。 1.2.6 供试溶液的制备 分别精密量取上述水煎液各25mL,上样至预处理好的D101大孔树脂柱(湿法装柱,高15cm,内径1.5cm),先用200mL 水冲洗,弃去水洗液;再用200mL 55%乙醇洗脱,最后用200mL 95%乙醇洗脱,分别收集,水浴蒸干,加甲醇使残渣溶解,分别转移至50mL容量瓶、1mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,进样前过0.22μm微孔滤膜。 1.2.7 色谱条件 Phenomenex Kinetex C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),以乙腈(B)-水(A)为流动相进行梯度洗脱,流速1.0mL·min-1,柱温30℃,蒸发光散射检测器(ELSD),氮气流速3.0mL·min-1。洗脱梯度1:0~15min,10%~20%B;15~24min,20%~24%B;24~25min,24%~10%B;洗脱梯度2:0~20min,38%~40%B;20~30 min,40% ~50%B;30~31min,50%~38%B。 2 结果与讨论 2.1 指纹图谱的建立和分析 2.1.1 精密度实验 取同一份疏肝理脾方水煎液的55%乙醇洗脱部位和95%乙醇洗脱部位,分别按洗脱梯度1、洗脱梯度2的色谱条件连续进样6针,采集色谱峰数据,计算相似度。结果表明,RSD均小于2%,表明仪器的精密度良好。 2.1.2 稳定性实验 取同一份疏肝理脾方水煎液的55%乙醇洗脱部位和95%乙醇洗脱部位,分别按洗脱梯度1、洗脱梯度2的色谱条件每隔2h进样,采集色谱峰数据,计算相似度,考察12h内的稳定性。结果表明,RSD均小于2%,表明供试溶液室温放置12h内稳定。 2.1.3 重复性实验 平行制备6份疏肝理脾方水煎液的55%乙醇洗脱部位和95%乙醇洗脱部位,分别按洗脱梯度1、洗脱梯度2的色谱条件进样,采集色谱峰数据,计算相似度。结果表明,RSD均小于3%,表明方法的重复性良好。 2.1.4 指纹图谱的建立 分别制备疏肝理脾方水煎液、柴胡单煎液、陈皮枳壳合煎液各10份,并按1.2.6方法分别制得55%乙醇洗脱部位和95%乙醇洗脱部位的供试溶液,分别按洗脱梯度1、洗脱梯度2的色谱条件进样,记录色谱图。将色谱图导入“中药指纹图谱相似度评价系统”(2012版)软件,计算各批次间的相似度,均大于0.9,并得到共有模式图,见图1。 2.1.5 共有峰的确定与色谱峰归属分析 对指纹图谱中峰面积占总峰面积比例>1%的色谱峰进行指认,共指认26个共有峰,柴胡单煎液的95%乙醇洗脱部位共有指纹峰10个,陈皮枳壳合煎液的55%乙醇洗脱部位共有指纹峰4个、95%乙醇洗脱部位共有指纹峰19个,疏肝理脾方水煎液的55%乙醇洗脱部位共有指纹峰4个、95%乙醇洗脱部位共有指纹峰23个。通过与对照溶液比较,确认2号峰为柚皮苷(t=20.23min),3号峰为橙皮苷(t=21.06min),4号峰为新橙皮苷(t=22.45min),12号峰为柴胡皂苷a(t=18.74min),14号峰为柴胡皂苷b(t=19.19min)。 将疏肝理脾方水煎液的指纹图谱分别与陈皮枳壳合煎液、柴胡单煎液的指纹图谱进行对比,可以看出:疏肝理脾方水煎液的55%乙醇洗脱部位4个色谱峰均来自陈皮、枳壳,依次为芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷,柴胡单煎液在此部位没有检出成分。疏肝理脾方水煎液的95%乙醇洗脱部位有5个色谱峰来自于柴胡,分别为8号峰、12号峰、14号峰、17号峰和18号峰;有15个色谱峰来自于陈皮、枳壳;另外,还有3个色谱峰为3种水煎液共有,说明三药配伍后没有生成新的化学物质。相反,有3个化学成分在配伍后检测不到,分别是柴胡单煎液中23号峰、24号峰,陈皮枳壳合煎液中的15号峰。疏肝理脾方化学成分的归属见表1。 2.2 样品中化学成分的含量测定 2.2.1 线性关系考察 精密吸取1μL、2μL、5μL、10μL、15μL、20μL混合对照溶液1,按洗脱梯度1的色谱条件分别进样,结果见图2a。精密吸取1μL、2μL、5μL、8μL、10μL、12μL混合对照溶液2,按洗脱梯度2的色谱条件分别进样,结果见图2b。以峰面积对数为纵坐标、进样质量对数为横坐标,绘制标准曲线,得到柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的回归方程,分别为y=1.3384x+5.27887(R=0.9973)、y=1.4778x+5.127(R=0.9968)、y=1.4438x+5.2354(R=0.9960),线性范围依次为0.504~10.08μg、0.34~6.8μg、0.309~6.18μg。得到柴胡皂苷a、柴胡皂苷b的回归方程,分别为y =1.4207x +4.6519(R=0.9975)、y =1.5649x+4.8164(R=0.9978),线性范围依次为0.1552~1.8624μg、0.1516~1.8192μg。 2.2.2 精密度实验 取混合对照溶液,按1.2.7项下色谱条件梯度洗脱,连续进样6次,记录峰面积。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b的峰面积的RSD分别为2%、1%、1%、2%、2%,表明仪器精密度良好。 2.2.3 稳定性实验 按1.2.6方法制备供试溶液,每隔2h进样,记录峰面积,考察12h内的稳定性。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b的峰面积的RSD分别为2%、2%、1%、2%、2%,表明供试溶液中待测成分常温下放置12h稳定。 2.2.4 重复性实验 按1.2.6方法平行制备6批供试溶液,按1.2.7项下色谱条件梯度洗脱,进样,记录峰面积。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b的平均含量分别为888.5μg·mL-1、504.0μg·mL-1、562.0μg·mL-1、7.3μg·mL-1、4.5μg·mL-1,RSD分别为3%、3%、2%、4%、5%,表示该方法重复性良好。 2.2.5 加样回收率实验 精密量取水煎液10mL,按100%比例加入对照品,按1.2.6方法平行制备6批供试溶液,按1.2.7项下色谱条件梯度洗脱,进样,记录峰面积,计算回收率。结果表明,回收率分别为:柚皮苷95.6%(RSD=1%),橙皮苷99.1%(RSD=3%),新橙皮苷96.6%(RSD=1%),柴胡皂苷a 97.8%(RSD=3%),柴胡皂苷b98.6%(RSD=3%)。 2.2.6 样品测定 分别制备疏肝理脾方水煎液、柴胡单煎液、陈皮枳壳合煎液各10份,经大孔树脂净化得55%乙醇洗脱部位和95%乙醇洗脱部位,按1.2.7项下色谱条件梯度洗脱,分别进样10μL、20μL,记录峰面积,运用外标两点法计算化学成分含量,见表2。 2.3 讨论 本科研团队前期采用HPLC-UVD法建立了柴胡疏肝散的指纹图谱,但因紫外检测器只识别有特征紫外吸收的化学成分,具有局限性,因此,本研究采用蒸发光散射检测器建立疏肝理脾方的全成分化学指纹图谱。另外,因为陈皮、枳壳均主要含黄酮类成分,并且含量远高于柴胡中的柴胡皂苷类,受检测器满量程的限制,只能把疏肝理脾方中成分分成两个洗脱部位分别检测,55%乙醇洗脱部位主要为含量较高的黄酮类,95%乙醇洗脱部位主要为柴胡皂苷类及黄酮苷元,均是含量较低的组分。 原方中陈皮为醋制,陈皮本身化痰止咳,醋炒后疏肝行气。枳壳为麸炒,后者的炮制方法在《中国药典》有详细的记载,但是陈皮的醋制只在《博济》中曾有过记载,推测因其药性与青皮对比较为缓和,在现代的炮制方法中只对青皮醋制做了记载,所以陈皮的炮制方法并无确定的方案,经咨询广州中医药大学炮制教研室的陈康教授后,决定采用2015年版《中国药典》中的醋炙方法制备醋陈皮饮片。 三药配伍后的HPLC图谱共有23个峰,其中5个峰来自于柴胡,15个峰来自于陈皮、枳壳合煎,3个峰为三者所共有,在三药配伍后并没有出现新的色谱峰,说明在三药配伍后并没有产生新的化学成分。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷三者含量均在三药配伍后减少,而柴胡皂苷a、柴胡皂苷b的含量均在配伍后增加,说明柴胡配伍陈皮、枳壳后会使柴胡皂苷a和b溶出率增加。那么疏肝理脾方的整体药效要比单煎液要好是否与柴胡皂苷的溶出率升高有关还有待更深入的研究。 3 结论 采用HPLC-ELSD研究疏肝药柴胡与理脾药陈皮、枳壳配伍前后主要化学成分的变化。色谱条件为:Phenomenex Kinetex C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),柱温30℃;以乙腈(B)-水(A)为流动相进行梯度洗脱,流速1.0mL·min-1;蒸发光散射检测器,氮气流速3.0mL·min-1。所有样品溶液经大孔树脂净化处理,得55%乙醇洗脱部位和95%乙醇洗脱部位。对供试溶液分别建立指纹图谱,并测定其中柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b的含量。结果表明,指纹图谱中共指认26个色谱峰,三药配伍后没有新的化学成分生成,但柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的含量减少,柴胡皂苷a、柴胡皂苷b含量显著升高。本研究建立了疏肝理脾方的HPLC-ELSD全成分指纹图谱,可以用于方中多个指标成分的同时测定。
  • [资讯] 地佐辛外用制剂的体外透皮特性比较
    地佐辛(dezocine1) 是新型桥环氨基四氢萘,是苯吗啡烷类衍生物,通过激动分布于大脑、脑干及脊髓的κ 受体产生镇痛作用;同时部分拮抗μ 受体,使其胃肠道不良反应少、呼吸抑制作用小、成瘾性低、安全性高。1 常用于术中、术后镇痛,其镇痛强度、起效时间和持续时间与经典阿片类药物吗啡相当。此外,它还可以预防麻醉药异丙酚引起的注射疼痛,效果与常用药利多卡因相似,但却更安全、更有助于提高异丙酚的稳定性。 目前1 上市产品只有注射液,使用不便、胃肠道不良反应较多,且大多发生在用药中、短期内,因此需要控制静脉滴速,时刻监视患者的临床情况。据文献报道,1 基础镇痛量为5 9 ng/ml,超过45 ng/ml 时开始出现不良反应。因1 起效浓度低、治疗窗窄,适用于制成外用制剂,不仅能实现缓释、减轻不良反应,而且使用方便,可随时中止用药。本试验对3 种不同的自制外用制剂进行不同皮肤上的体外透皮特性比较,探究皮肤对药物筛选及剂型的影响,并为1 外用制剂的开发提供更多的参考。 1 仪器与试药 LC-20A 型高效液相色谱仪( 日本Shimadzu 公司) TK-20B 型透皮扩散仪( 垂直式,上海锴凯科技贸易有限公司) ? 型透皮贴片涂布机( 药物制剂国家工程研究中心) 5424R 型高速冷冻离心机( 德国Eppendorf 公司) 1 原料药( 扬子江药业集团, 含量99 %, 批号R14091601-1) ;丙烯酸酯压敏胶( 德国Henkel 公司,型号Duro-Tak 87-2510Duro-Tak 7-4302) ;羟丙纤维素(HP,上海森君化工制剂辅料有限公司) ;甘油( 湖南尔康制药股份有限公司) ;肉豆蔻酸异丙酯( IPM,日本关东化学株式会社);月桂氮酮( 福建寿宁美菲思生物化学品厂);甲醇( 色谱纯,Merck 公司) ;纯净水( 杭州哇哈哈集团有限公司) ;磷酸二氢钾、氢氧化钠、三乙胺、磷酸、乙酸乙酯( 国药集团化学试剂有限公司) SD 大鼠( 雌性,约20 g,上海市西普尔- 必凯实验动物有限公司,动物合格证编号20130016005182) ;巴马小香猪(2 周龄,雄性,上海甲干生物科技有限公司,动物合格证编号2010002803777) 2 方法与结果 2.1 制剂的制备 贴片:以IPM 为促渗剂,设计含药量为5%的处方。先将1 溶解于一定量乙酸乙酯中,加入相应量压敏胶(Duro-Tak 87-2510 Duro-Tak 7-4302 按一定比例混合后使用),搅拌均匀并静置脱气。然后将涂布机升温至85 ℃,调整涂布厚度进行涂布,并用模具切割成1.58 cm×1.58 cm( 面积为2.5 cm2)的正方形贴片( 含药量1 mg/cm2) 凝胶:取适量水作为溶剂,加入5%甘油做保湿剂、5%月桂氮酮作促渗剂,然后加入1 的无水乙醇溶液,最后加入2 HP 溶液,溶胀过夜,搅拌均匀,即得含药量2%的凝胶。 溶液:将1 溶于适量无水乙醇中,加入水、5%甘油( 保湿剂),搅拌均匀,使含药量为2%。 2.2 皮肤的处理 SD 大鼠皮肤:剃除SD 大鼠背部皮肤毛发,涂抹脱毛膏,5 min 后洗净。24 h 后取下脱毛的背部皮肤,除掉皮下毛细血管和脂肪组织,用铝箔包好,置-20 ℃冰箱中保存。使用前需放至室温,生理盐水洗净,肉眼观察无破损即可进行试验。 新生猪皮:将巴马小香猪脱去毛发,取下的背部皮肤须除掉皮下毛细血管和脂肪组织,用铝箔包好,置-20 ℃冰箱中保存。使用前需放至室温,生理盐水洗净,肉眼观察无破损即可进行试验。 2.3 体外分析方法的建立 2.3.1 溶液配制 对照品溶液:精密称取1 原料药 10.65 mg,置10 ml 量瓶中,加入少量甲醇,超声溶解,用甲醇定容,摇匀,配制得到1 065 μg/ml 的贮备液,置4 ℃冰箱密封避光保存。临用前放至室温,精密量取贮备液1 ml 50 ml 量瓶中,加入甲醇∶三乙胺(1 1) 定容,得到21.3 μg/ml 对照品溶液。 2.3.2 色谱条件 色谱柱 XTerra® RP18 (4.6 mm×150 mm5 μm) ;流动相 pH 3.0 三乙胺∶甲醇(65 35) ;检测波长 282 nm ;流速 1.0 ml/min ;柱温 40 ;进样量 20 μl 2.3.3 专属性试验 pH 6.8 磷酸盐缓冲液[PBS,根据《中华人民共和国药典》(ChP)2015 年版四部通则配制]、空白猪皮肤浸出液、空白大鼠皮肤浸出液、1 对照品溶液、8 h 体外透鼠皮样品,照“2.3.2”项下条件进样测定。色谱图见图1。结果表明1 的保留时间均为5.3 min,说明皮肤中内源性物质对测定无干扰,该方法专属性较强。 2.3.4 线性范围与定量限 精密移取1 贮备液适量,用pH 6.8 PBS 逐级稀释,配制成浓度分别为0.130.802.6613.3153.25133.10266.20 532.50 μg/ml 的线性对照品溶液。照“2.3.2”项下条件进样测定,记录色谱图,以峰面积(A) 为纵坐标,浓度( c) 为横坐标,进行线性回归分析,得标准曲线方程为A=12 036c-1 023.3r=0.999 8。说明1 浓度在0.13 532.50 μg/ml范围内线性良好。本法定量限为99.8 ng/ml(S/N 10) 2.3.5 回收率试验 分别精密量取1 贮备液,加入空白皮肤的24 h浸出液,稀释成低、中、高浓度(2.66133.10532.50 μg/ml) 的样品溶液,各3 份。分别离心,取上清液,照“2.3.2”项下条件进样测定,计算得1平均回收率为100.2%,RSD 2.01 (n=9),证明该法能准确测定1 的累积透皮量,方法可行。 2.4 体外透皮试验 2.4.1 试验方案 采用Franz 立式透皮扩散池进行体外透皮试验,水浴温度32 ℃、搅拌速度200 r/min,接收池体积8.0 ml,有效透过面积为3.14 cm2,接收介质为pH 6.8 PBS。揭去贴片防黏层,使其与皮肤紧密接触,固定于接收池上;将凝胶均匀涂布于供给池内皮肤上;溶液均匀倾倒于供给池内( 给药量均为2.5 mg) ;分别于0.51246824 h 取样0.3 ml( 及时补加同温等量介质),离心(13 523.2×g)3 min,取上清液进样分析。 2.4.2 试验结果 根据标准曲线计算各采样点样品中的药物浓度,照下式计算单位面积累积透过量(Q) 式中,cn 为第n 个时间点测得的浓度;ci 为第i 个时间点测得的浓度;A 为有效透皮面积(3.14 cm2)。绘制Q-t 曲线,对曲线中直线部分进行线性拟合,所得的斜率即为稳态透过速率JS,与X 轴的截距即为时滞tL,结果见表1 和图2 2.5 统计分析结果 对不同组的累积透皮量和稳态透过速率分别用GraphPad 6.0 软件的two-way ANOVA 检验和Linearregression 做显著性分析。首先比较同一剂型条件下2 种皮肤对1 透过性能的影响,其次比较同种皮肤条件下1 不同剂型的差异性。结果表明,在设置显著性水平α=0.05 的条件下,同一剂型( 贴片、凝胶、溶液) 的累积透皮量和稳态透过速率在大鼠皮肤和乳猪皮肤间有显著差异(P<0.05)。对于同种皮肤、不同剂型的累积透皮量和稳态透过速率的统计学分析结果则见表2 3 讨论 3.1 皮肤的影响 由“2.5”项下的统计结果可见,对同一剂型,鼠皮和猪皮的累积透皮量和稳态透过速率均有显著性差异,结合图2 可知:大鼠皮肤通透性比猪皮好,药物的累积透皮量高,则其对不同剂型的区分度更高,因此更适用于前期处方的区分及筛选。而据文献报道,猪皮的屏障作用更接近于人皮肤,因此更适用于评价药物透皮性能,建立体内外相关性。 由图2 可知,3 种剂型在不同皮肤中累积透皮量曲线的变化趋势有所不同,这是因为药物主要经角质层细胞间类脂双分子层进入活性表皮。因此,对于角质层较薄的大鼠皮肤,偏水性的凝胶和溶液剂较易透过;而对于角质层较厚的猪皮,脂溶性较大的贴片透皮量相对升高,和其余两剂型的差异性降低。 3.2 剂型的影响 1 溶液在2 种皮肤上24 h 累积透皮量都较高,但图2 显示其在不同皮肤上释放曲线不同,尤其在猪皮上,前期时滞长,释放速率不均匀,起效慢,治疗期窄,同时溶液具有不易定量、不易贮存等缺点,因此往往不是外用剂型的首选。 在大鼠皮肤上,1 凝胶的累积释放量比贴片高,且有统计学意义( 见表2),经释放模型拟合,凝胶中的药物释放更接近Higuchi 模型(Q= 282.4t1/2-177.0R2=0.957 3),贴片中的药物释放曲线更接近于零级模型,更能充分体现外用制剂缓释、长效的优势。结合图2B 所示,贴片在更接近于人皮肤特性的乳猪皮肤上释放量反而偏高,虽然整体曲线没有显著性差异,但稳态透过速率差异性显著。因此,1 贴片更趋近于零级释放、释药更稳定,且角质层越厚,其释放量相对越高,更符合长效稳态镇痛的需求。1 凝胶在鼠皮上释放量较高,在猪皮上虽渗透性能相对变差,但通过调整处方优化其油水分配系数进而提高其渗透性能,也可达到有效治疗浓度。 文献指出,1 虽强效镇痛、不良反应少,但治疗窗窄、维持时间短。1 用于超前镇痛、中晚期癌痛治疗等,推荐剂量为0.1 mg/kg ;用于全麻诱导,推荐剂量为0.1 0.15 mg/kg ;术后镇痛则为0.25 0.3 mg/kg ;且镇痛效果呈剂量依赖性,剂量上限为0.3 mg/kg。因此,倾向于零级释放且易定量的贴片更适合1 的给药,可以通过调整贴片面积,以达到不同治疗效果,用于不同的临床症状。
  • [资讯] 肝素结合蛋白对免疫功能受损合并重症肺炎患者病情严重程度及预后的评估价值
    近年来,随着实体器官移植、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等患者的增多,免疫抑制剂、糖皮质激素、细胞毒性药物应用愈加广泛,临床上免疫功能受损患者明显增多。免疫功能受损患者极易合并感染,肺部感染常见,即使接受强有力的抗感染治疗,死亡率仍较高。由于免疫抑制合并重症肺炎的进展迅速,早期即可出现呼吸衰竭及多脏器功能障碍,预后较差,早期诊断并判断病情及预测预后十分重要。本研究探讨肝素结合蛋白对免疫抑制合并重症肺炎患者病情严重程度及预后判断的价值。 1 资料与方法 1 1 一般资料 选取2017 12 月至2018 11 月郑州大学第一附属医院呼吸重症监护病房( respiratoryintensive care unit,RICU) 收治的89 例重症肺炎患者,根据免疫功能是否受损分为免疫功能受损组( 50 )和免疫功能正常组( 39 ) ,根据临床结局将免疫受损患者分为死亡组( 30 ) 和存活组( 20 ) 。免疫功能受损患者包括自身免疫性疾病、原发性免疫缺陷综合征、慢性肾功能衰竭、血液透析、终末期肝病、恶性肿瘤、实体器官移植及造血干细胞移植患者,重症肺炎参照2016 年中华医学会制定的重症肺炎或社区获得性肺炎的诊断标准。纳入及排除标准: 纳入符合免疫功能受损入组标准之一及重症肺炎诊断标准患者,排除年龄< 14 岁及> 80 岁、急性心脑血管疾病、妊娠妇女、临床资料不完整、住院时间不足48 h 患者。免疫功能抑制组男30 例,女20 例,年龄21 79 岁,平均( 55. 48 ± 16. 78) ; 免疫功能正常组男28 例,女11例,年龄20 79 岁,平均( 60. 69 ± 16. 36) 岁。两组患者一般资料比较,差异无统计学意义( P 0. 05) 。患者及家属自愿参与本研究并签署知情同意书。本研究经医院医学伦理委员会审批通过。 1 2 方法 1 2 1 标本采集 所有患者入院后24 h 内进行慢性健康状况评分系统Ⅱ( acute physiology and chronichealth evaluation Ⅱ,APACHE ) 评分,并于入院第1天抽取外周静脉血3 mL 检测外周血淋巴细胞亚群,反映机体免疫功能状态,同时抽取外周血3 mL 进行血清降钙素原( procalcitoninPCT ) 及肝素结合蛋白( heparin binding proteinHBP) 水平检测。 1 2 2 实验步骤 采样: 入院24 h 内对全部患者进行静脉抽血10 mL,将抽取的血样放置不含抗凝剂的试管内,于常温下静置30 min,然后进行15 min1 000 r /min的离心操作,取上清液( 即为血清) ,于- 20 下保存等待检测。检测: HBPPCT 检测采用酶联免疫吸附法,外周血淋巴细胞亚群采用流式细胞术,检测总T 细胞( CD3 细胞) CD3 +CD4 +CD8 +T 细胞及CD4 + /CD8 + 1 2 3 结局终点评价 根据患者入院28 d 后是否存活,分为存活及死亡两种结局。 1 3 统计学方法 采用SPSS 21. 0 统计学软件处理数据,符合正态分布的定量资料以均数± 标准差(`x ± s) 表示,采用t 检验,非正态分布的定量资料用M( Q) 表示,组间比较采用Mann Whitney U 检验,定性资料以率( %) 表示,组间比较采用χ2 检验,两变量间相关性采用Spearman 相关分析。建立受试者工作特征( receiver operating characteristic,ROC) 曲线并计算曲线下面积以检验指标的预测价值。P 0. 05 为差异有统计学意义。 2 结果 2 1 PCTAPACHE Ⅱ评分、HBP 及淋巴细胞亚群 免疫功能受损组PCTAPACHE Ⅱ评分、HBP 均高于免疫正常组,CD3CD4 +CD8 + CD4 + /CD8 + 均低于免疫功能正常组,差异有统计学意义( P 0. 05) 。见表1 2 2 死亡率 免疫功能受损组患者死亡率[60. 00%( 30 /50) ]高于免疫功能正常组[30. 77%( 12 /39) ],差异有统计学意义( P 0. 05) 2 3 死亡组和存活组PCTAPACHE 评分、HBP 死亡组PCTHBPAPACHE Ⅱ评分均高于存活组,差异有统计学意义( P 0. 05) 。见表2 2 4 免疫功能受损患者HBP PCT APACHEⅡ评分的相关性 血清HBP 水平与PCT 呈正相关( r = 0. 623P 0. 05) 。血清HBP 水平与APACHE Ⅱ评分呈正相关( r = 0. 294P 0. 05) 2 5 HBPPCT APACHE Ⅱ评分预测免疫功能受损合并重症肺炎患者预后 由ROC 曲线分析可知,最大曲线下面积是HBP( 0. 725) ,其次是APACHE Ⅱ评分( 0. 721) ,最小是PCT( 0. 710) HBP 最佳截断值为139. 39 ng /mL,灵敏度为0. 600,特异度为0. 898;APACHEⅡ评分最佳截断值为20. 50 分,灵敏度为0. 633,特异度为0. 780; PCT 最佳截断值为2. 11 μg /L,灵敏度为0. 633,特异度为0. 746。见图1 3 讨论 重症肺炎是RICU 常见疾病,免疫功能受损合并重症肺炎患者并不少见。感染初期,患者可能无明显临床症状或仅表现为轻微的咳嗽、胸闷等,给临床诊断及治疗造成极大的挑战。进展快,常伴有强烈的全身炎症反应,可诱发脓毒症及多脏器功能障碍,预后往往较差,早期诊断和及时启动有效治疗可有效降低免疫功能受损合并重症肺炎患者的病死率。HBP 是激活的中性粒细胞释放的一种蛋白分子,当中性粒细胞黏附于血管内皮时或受到循环中细菌代谢产物刺激时释放。HBP 可以促使内皮细胞骨架重排,导致血管内皮屏障破坏,促进白细胞从毛细血管迁移到感染部位,并可以增加血管通透性。有研究表明,HBP 在炎症反应调节中也起到重要作用,可通过激活单核/巨噬细胞,释放肿瘤坏死因子α、干扰素- γ 等炎性介质,对炎症反应起到放大作用并导致泄露,与低血压及循环衰竭的发生密切相关。 本研究结果发现,免疫受损合并重症肺炎患者病情更重,预后更差。两组患者PCT 水平及APACHEⅡ评分存在差异,并与死亡趋势一致,符合其评价患者危重程度及预后的特征。死亡组患者PCTHBPAPACHEⅡ评分均高于存活组,提示HBPPCT APACHE Ⅱ评分高水平可能与其相关。相关分析提示,免疫功能受损组患者HBP 水平与PCT 水平及APACHE Ⅱ评分均呈正相关,提示免疫功能受损合并重症肺炎患者HBP 水平与病情严重程度有关。ROC曲线显示,HBP 对免疫功能受损合并重症肺炎患者死亡的预测价值最大,具有较高的敏感度及特异性,早期检测HBP 水平可尽早发现感染及预测临床结局。这与Linder 等研究一致。 综上,HBP 在免疫功能受损合并重症肺炎患者中升高,其水平与病情严重程度相关,且能判断预后,HBP 水平越高,病情越重,病死率越高。HBP 可作为判断免疫功能受损合并重症肺炎患者预后的可靠指标,指导诊断及治疗。
  • [资讯] 西格列汀联合二甲双胍治疗老年2 型糖尿病疗效及安全性的临床研究
    2 型糖尿病( T2DM) 是临床最为常见的DM 类型,约占所有DM 90%以上。老年人是T2DM 的高发人群,受胰岛素功能慢性损伤和血糖升高影响,多表现为多饮、多尿、多食、消瘦和疲乏无力等症状,且随病情进展增加不良心脑血管事件发生风险,严重影响身心健康和生活质量。因此,早期及时诊断T2DM 和采取积极有效的治疗措施,对控制病情和保护胰岛B 细胞功能意义重大。二甲双胍是临床治疗T2DM 的首选药物,对稳定病情、控制血糖达标具有一定积极效果,但实际中仍有部分患者控糖效果不佳,引起临床的广泛重视。随着T2DM 临床研究的不断深入,不同作用机制的口服降糖药物联合对降糖具有增益作用。目前国外关于西格列汀联合二甲双胍治疗T2DM 的报道较多,但大多侧重于血糖控制效果观察,而对于2 者联合治疗T2DM 的安全性尚无明确定论。西格列汀于2006 年批准引入我国治疗T2DM,我国使用西格列汀的时间不长,临床经验相对缺乏。且医学上关于西格列汀对患者心血管是否有影响也一直存在争议,关于老年T2DM 联合治疗的大样本临床报道更是偏少。据此本研究设置分组对照,探讨西格列汀联合二甲双胍在老年T2DM 临床治疗中的应用价值,报道如下。 1 资料与方法 1 1 一般资料选取我院2016 6 月至2018 12月收治的220 例老年T2DM 患者。纳入标准: ( 1) 均符合美国糖尿病协会( ADA) 最发布糖尿病诊疗标准( 2017 年版)中“2 型糖尿病”相关描述; ( 2) 年龄60 80 ; ( 3) 患者和( ) 家属对本研究知情并签署知情同意书。排除标准: 初诊的T2DM 患者,1型糖尿病患者,严重血液疾病者,严重心脑血管疾病者,急性感染者和严重脏器病变者,糖尿病足者。将纳入患者按就诊先后次序将其分为对照组100 例和观察组120例,其中对照组男58 例,女42 ; 年龄60 78 岁,平均年龄( 68 4 ± 7 1) ; 病程2 6 年,平均( 4 0 ±1 3) 年。观察组男71 例,女49 ; 年龄61 79 岁,平均年龄( 68 7 ± 7 0) ; 病程2 8 年,平均( 4 1 ±1 4) 年。本研究经院伦理委员会审核批准,2 组性别比、年龄及病程方面差异无统计学意义( P 0 05) ,具有可比性。 1 2 治疗方法所有患者接受T2DM 健康宣教、严格控制饮食、积极运动锻炼、皮下注射人胰岛素等基础治疗。对照组给予二甲双胍( 商品名: 格华止,盐酸二甲双胍片; 中美上海施贵宝制药有限公司生产) 治疗,口服, 500 g /次,3/d。观察组在对照组基础上联合西格列汀( 商品名: 捷诺维,磷酸西格列汀片; 杭州默沙东制药有限公司生产) 治疗,晨起口服,100 mg /次,1 /d2 组均持续治疗6 个月,治疗期间注意事项均谨遵医嘱。 1 3 观察指标( 1) 分别于治疗前后生化检测2 组老年T2DM 患者空腹血糖( FBG) 、餐后2 h 血糖( 2 hPG) 、糖化血红蛋白( HbA1c) 的表达。检测方法: 受检者于晨起抽取静脉血5 ml,常规3 000 r /min 离心5 10 min,取清澈血清样本于低温环境中冷存以备检测。采用葡萄糖氧化酶法检测血清FBG2 hPG 表达水平,采用高压液相色谱法检测HbA1c,依次编号记录输入excel 表格。( 2) 参考ADA 最新发布糖尿病诊疗标准( 2017 年版) 中“2 型糖尿病”疗效标准评估2 组临床疗效。显效: 血糖下降幅度≥3 0 mmol /L,“3 多”症状明显改善; 有效: 血糖下降幅度2 2 3 0 mmol /L,“3多”症状有一定减轻; 无效: 血糖下降幅度< 2 2 mmol /L或无变化或继续上升,“3 多”症状较治疗前无可见改善甚至加重。治疗总有效率= ( 显效+ 有效) /总数×100%( 3) 结合临床观察、患者主诉、心电图、肝肾功能检查结果,记录2 组治疗期间相关不良反应情况。 1 4 统计学分析应用SPSS 20 0 统计软件,计数资料采用χ2 检验; 计量资料以`x ± s 表示,满足正态分布和方差齐性后,组间数据相较行独立样本t 检验,同组不同时点数据相较行配对样本t 检验。P 0 05 为差异有统计学意义。 2 结果 2 1 治疗前后血糖指标变化比较2 组均谨遵医嘱完成治疗,无中途退出病例。2 组治疗前FBG2 hPGHbA1c 差异无统计学意义( P 0 05) ,治疗后上述指标较治疗前均有显著下降( P 0 05) ; 观察组治疗后2 hPGHbA1c 下降较对照组更为显著,差异有统计学意义( P 0 05) 。见表1 2 2 临床总有效率比较观察组治疗总有效率为89 17%( 107 /120 ) ,显著高于对照组79 00% ( 79 /100) ,差异有统计学意义( P 0 05) 。见表2 2 3 不良反应情况比较2 组治疗后心电图、肝肾功能检查均无异常改变,治疗期间均未出现低血糖( 血糖值< 3 9 mmol /L) 和其他严重不良反应。2 组常见不良反应主要为便秘、腹痛、上呼吸道感染、头痛,经简单对症处理好转或未处理自行好转,未影响治疗。观察组总不良反应率16 67% ( 20 /120 ) 较对照组25 00%( 25 /100) 低,差异无统计学意义( P 0 05) 。见表3 3 讨论 随着社会生活节奏加快、饮食习惯改变和老龄化进程加快,相关报道显示我国已成为世界上DM 患者最多的国家,且呈现DM 发病率逐渐上涨、发病年龄逐渐年轻化的趋势,给家庭和社会带来沉重负担。T2DM 作为一种以慢性高血糖为特征的代谢性疾病,可导致全身多器官系统受累并产生慢性病变。同时临床收治T2DM 病例中老年人所占比重较大,老年T2DM 患者受机体功能衰退、免疫力下降等因素影响,较易出现T2DM 并发症如糖尿病足、视力衰退等,加剧其他脏器系统病变如糖尿病肾病、非酒精性脂肪肝以及心血管疾病的风险,给临床老年T2DM 的治疗带来严峻挑战。二甲双胍是目前治疗T2DM 的首选降糖药, 2017 最新发病的ADA 的诊疗指南中,将二甲双胍作为一线治疗药物并贯穿整个治疗过程,其作用机制主要是延缓葡萄糖由胃肠道的摄取,通过提高胰岛素的敏感性而增加外周葡萄糖的利用,以及抑制肝、肾过度的糖原异生。但近年来临床发现单独使用二甲双胍治疗的敏感性逐渐减弱,因此常联合其他作用机制的降糖药如西格列汀治疗。但二者联合治疗老年T2DM 的安全性尚存在疑问,且联合治疗是否能让患者获益尚需临床大样本报道论证。 本研究对220 例老年T2DM 患者分组对照,2 组均成功完成治疗,无中途退出病例。结果显示观察组治疗6 个月后FBG2 hPGHbA1c 较治疗前均有明显下降( P 0 05) ,且上述血糖指标下降程度明显优于对照组( P 0 05) ,和Ji 等研究相吻合,说明西格列汀联合二甲双胍较单独二甲双胍治疗老年T2DM,可取得更为满意的血糖控制效果。笔者分析认为二甲双胍上述药理机制中并未对胰岛素的分泌产生影响,单纯提高胰岛素的敏感性和抑制肝肾过度糖原异生可能是导致血糖控制效果欠佳的主要原因。而西格列汀作为一种高效二肽基肽酶-4 抑制剂,口服后能在24 h 内抑制二肽基肽酶-4,从而使活性GLP-1 GIP的循环浓度升高2 3 倍、增加胰岛素和C 肽的血浆水平、降低胰高糖素水平、降低空腹血糖并减少口服葡萄糖负荷或进食后的血糖波动。此外有报道指出联合治疗不仅不会影响二甲双胍、西格列汀的药代动力学,而且二者存在互补优化作用,协同二甲双胍进行降糖和胰岛素调控,能产生更为显著的血糖控制效果。本研究中观察组临床总有效率为89 17%( 107 /120) ,显著高于对照组79 00% ( 79 /100) ( P 0 05) ,也说明联合治疗对老年T2DM 患者的显著应用优势。二甲双胍联合治疗T2DM 的安全性一直是困扰广大医师的难题,以往单一二甲双胍控糖效果不佳时,会考虑联合磺脲类、格列奈类胰岛素促泌剂等强化治疗,但易导致低血糖情况对老年人危害加大,且并不能改善胰岛β 细胞功能,提示对老年T2DM 的应用价值并不显著。而本研究联合西格列汀治疗取得满意的安全性效果,2组治疗均未出现低血糖,治疗前后心电图、肝肾功能检查均无异常改变,仅出现便秘、腹泻、上呼吸道干扰以及头痛等常规轻微症状,经简单处理或未处理自行好转,且2 组不良反应率差异无统计学意义( P 0 05) ,和文献报道相一致,以上说明联合西格列汀不仅起到抑制内源性肠促胰岛素、葡萄糖依赖性促腺胰岛素释放的效果,而且联合治疗并不会增加药物不良反应,安全性值得肯定。 综上所述,西格列汀联合二甲双胍治疗老年T2DM 患者有助于优化血糖控制效果,且安全性较好,为临床治疗老年T2DM 提供了更多血糖控制的选择,值得在不同层级医院推广应用,可产生节约T2DM 患者治疗开支、减轻社会医疗负担的经济社会价值。
  • [资讯] 利拉鲁肽对2型糖尿病心血管事件和全因死亡率的影响
    2型糖尿病(Type 2diabetes mellitus,T2DM)是全球公共卫生面临的最严峻挑战之一,据国际糖尿病联盟统计,预计到2025年,全球将有3.8亿人受到糖尿病的困扰。据国家卫生部调查显示,我国每天约新增病例3 000例,每年约增加120万糖尿病患者,其中约95%为2型糖尿病患者。而糖尿病的死亡率存在明显的地区差异和人群差异,从0~200/10万不等。心血管疾病被认为是T2DM全因死亡的主要原因,T2DM 发病越早,并发症越多,例如血压升高、血脂异常、动脉硬化、心力衰竭等,心血管事件死亡的风险较高。因此,T2DM预防和控制的主要目标是降低心血管事件的发生。利拉鲁肽是一种胰高血糖素样肽1(GLP-1)类似物,能有效促进受损胰岛β细胞功能的恢复,抑制胰高血糖素的分泌,并具有良好的抗低血糖和体质量增加作用,但对患者心血管事件的影响存在争议。本研究旨在探讨利拉鲁肽对2型糖尿病患者心血管事件和全因死亡率的影响,现报道如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料 选取2018年1-3月在成都市第二人民医院住院诊断为2型糖尿病患者共200例,采用随机数字表法分为2组(利拉鲁肽组和对照组),每组各100例。利拉鲁肽组中男性52例,女性48例,年龄45~72岁,平均年龄(59.93±11.28)岁,病程6~84个月。对照组中男性50例,女性50例,年龄46~70岁,平均年龄(61.23±9.27)岁,病程6~81个月。2组基本情况比较差异无统计学意义(P >0.05),具有可比性。本研究通过医院伦理委员会审批,并且所有患者或家属均签署知情同意书。 1.2 纳入与排除标准 纳入标准:符合2型糖尿病诊断标准;意识清晰,理解、沟通能力良好。排除标准:1型糖尿病患者;合并其他代谢性疾病或恶性肿瘤;肝肾功能异常者;合并严重感染。 1.3 常规治疗 所有患者入院时均常规给予硝酸酯类、阿司匹林、氯吡咯雷、他汀类、钙拮抗剂、β受体阻滞剂、低分子肝素等相关治疗药物。合并高血压、高血脂的患者积极控制血压、血脂,使血压、血脂水平稳步下降。 1.4 分组治疗 对照组给予饮食、运动治疗,三餐前皮下注射门冬胰岛素,睡前皮下注射甘精胰岛素,根据空腹血糖水平给予起始剂量并调整胰岛素剂量。利拉鲁肽组患者在饮食、运动及睡前皮下注射甘精胰岛素治疗基础上,加用利拉鲁肽注射液(商品名诺和力,丹麦诺和诺德制药公司,规格为3mL∶18mg),每日1次,于早餐前皮下注射。起始剂量为0.6 mg/d,使用之后无不良反应时加量为1.2mg/d。连续治疗6个月。 1.5 随访情况 2组患者均随访36个月,每1个月嘱患者来院复查1次,记录用药情况、心血管事件、全因死亡事件等。2组患者均无失访记录,随访率为100%。 1.6 不良心血管事件评估 随访期间对2组患者发生非致死性心肌梗死、再次心梗、心力衰竭、非致死性卒中、冠状动脉旁路移植术(CABG)、微血管病变等情况进行记录。并对2组患者上述指标进行比较分析。 1.7 全因死亡发生率 随访记录2组患者全因死亡人数、死亡时间等信息,绘制Kaplan-Meier生存曲线,比较2组生存率差异。 1.8 统计学分析 采用SPSS19.0软件进行统计学分析。计量资料结果以均数±标准差(`χ±s)表示,组间比较采用t检验,计数资料和率的比较用χ 检验,Kaplan-Meier法估计生存率,以P <0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 干预前用药情况 2组患者干预前用药剂量、时间均按照药品说明书推荐剂量使用。干预前2组用药情况差异无统计学意义(P >0.05),具有可比性,为后续试验奠定基础(见表1)。 2.2 2组不良心血管事件比较 2组患者不良心血管事件比较后发现,利拉鲁肽组非致死性心肌梗死、再次心肌梗死、心力衰竭、非致死性脑卒中、微血管病变发生率明显低于对照组(P <0.05),但CABG术发生率与对照组相比差异无统计学意义(P >0.05)。说明利拉鲁肽能有效降低2型糖尿病患者不良心血管事件的发生(见表2)。 2.3 2组全因死亡率比较 利拉鲁肽组全因死亡患者8例,死亡率为8.00%。对照组全因死亡患者10例,死亡率为10.00%。2组患者全因死亡率差异无统计学意义(χ=0.583,P =0.750)。说明利拉鲁肽不能降低全因死亡率。 2.4 2组生存曲线比较 采用Kaplan-Meier法绘制累积生存曲线,结果显示随访36个月后,利拉鲁肽组患者累积生存率为43.85%,明显高于对照组患者的累积生存率(36.84%),差异具有统计学意义(P <0.05),见图1,说明利拉鲁肽有利于2型糖尿病患者的生存。 3 讨论 本研究结果表明,利拉鲁肽可以减少2型糖尿病患者不良心血管事件的发生,但CABG术发生率与对照组相比差异无统计学意义。Marso等报道利拉鲁肽组患者的心力衰竭住院率低于安慰剂组,但差异无统计学意义。段春梅等荟萃分析显示利拉鲁肽可以降低T2DM 患者心血管事件的发生率,且能够显著地降低T2DM 患者的病死率。由此可见利拉鲁肽对于2型糖尿病患者心血管事件的影响仍然存在争议。 利拉鲁肽为一种人工合成的酰化胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物,具有降糖作用。利拉鲁肽可对糖尿病患者体内的GLP-1受体发挥多靶点效应,避免了诱发心血管疾病的多种危险因素。刘静芹等研究认为利拉鲁肽对糖尿病患者心肌具有保护作用。这种保护作用可能是通过激活PI3K/AKT/mTOR 信号通路而实现的,PI3K 信号通路不仅可增加心肌葡萄糖氧化和心肌细胞存活率,而且可使心肌底物代谢与凋亡建立联系。 虽然利拉鲁肽能有效降低不良心血管事件的发生率,但是其不能改善心脏收缩功能。Kumarathurai等研究发现,与安慰剂组比较,利拉鲁肽在低应力和高峰应激时不能改善静息时左心室射血分数。利拉鲁肽并未改善多巴酚丁胺负荷超声心动图(DSE)期间左心室的收缩功能。本研究结果显示,利拉鲁肽组的全因死亡率虽低于对照组,但差异无统计学意义。虽然利拉鲁肽不能改善心脏收缩功能,但是其有利于改善心脏舒张功能。Saponaro等报道在利拉鲁肽组中,二尖瓣环的舒张早期速度显著增加,二尖瓣环的外侧和内侧的早期到晚期速度均显著增加。在2型糖尿病患者中,6个月的利拉鲁肽治疗与舒张功能的显著改善相关,说明利拉鲁肽可以缓解心脏不良事件。 本研究结果表明,利拉鲁肽可降低非致死性卒中发生率,原因可能为利拉鲁肽能够有效降低血脂水平,减少动脉粥样硬化斑块的形成。李利斌等研究表明利拉鲁肽可有效降低2型糖尿病合并脑血栓患者高敏C反应蛋白和血脂水平,同时显著减少颈动脉粥样硬化斑块的形成,利于改善患者脑部供血,减少急性脑血管事件的发病率。其机制可能为GLP-1受体激动剂可缓解TNF-α所介导的纤溶酶原激活物抑制因子(PAI-1)表达增强,抑制平滑肌细胞增殖及抑制高糖诱导的内皮细胞凋亡,刺激一氧化氮(NO)的产生及促进内皮细胞增生,稳定内皮环境及减轻损伤,从而延缓动脉粥样硬化的病程。 除此之外,利拉鲁肽可以改善心脏代谢的因素如糖化血红蛋白、收缩压(SBP)和体质量,通过对其积极作用而影响心脏功能。另外,利拉鲁肽可以增强内皮功能、促进胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体的表达。因此利拉鲁肽可直接或间接地降低主要不良心血管事件(MACE)风险降低。总之,本研究通过随访研究发现,利拉鲁肽可以有效降低2型糖尿病患者不良心血管事件的发生率,虽然全因死亡率无明显变化,但生存曲线明显优于对照组,此结果可为临床治疗提供一定的理论依据。
  • [资讯] 基于维生素D 轴探讨黄芪多糖对脓毒症肾上腺皮质功能的保护机制
    ( ) 伤、休克、感染等临床危急症是脓毒症常见的并发症,是当今国际上内、外科所面临的棘手难题之一。其病情进展迅速、病死率高是脓毒症的危害之处,且易诱发脓毒症休克以及多器官功能障碍综合征( MODS) ,给临床救治工作带来了极大的困难与挑战。 1 肾上腺皮质在发生脓毒症时结构与功能的改变 下丘脑- 垂体- 肾上腺( hypothalamic pituitary adrenalHPA) 轴参与免疫系统功能的调控作用,同时HPA 轴也通过免疫系统所分泌的多种细胞因子和激素样物质起到反馈作用。患者在疾病危急情况下,导致发病率和病死率的增高的原因是由于机体无法激活HPA 轴、增加皮质醇的产生而导致的。目前认为肾上腺皮质激素水平在严重的应激状态下不能相应增加与身体相适应,是一种病理状态。脓毒血症发生时,神经内分泌系统的HPA 轴作为重要的调控途径。HPA 轴的负反馈调节机制在休克时受到损伤,导致内分泌系统功能的紊乱,器官功能损害,出现肾上腺皮质功能相对不全。据报道,重症患者同时伴随发生肾上腺皮质功能不全的情况在30% 70% 之间。研究表明,感染性休克的发病机制中发挥重大作用是免疫、凝血以及神经内分泌系统。感染性休克患者预后在一定程度上是由HPA 轴的改变直接影响神经内分泌改变来决定的。治疗感染性休克的新途径可能是通过调整肾上腺的功能状态来实现。 糖皮质激素是由肾上腺皮质分泌合成的,可以收缩血管,改善微循环障碍,在感染性休克的发生、发展中发挥重要作用。在休克的情况下,内毒素及细胞因子作用于肾上腺皮质,导致结构和功能的损伤。内毒素休克大鼠的肾上腺皮质束状带不同部位可出现明显的充血、水肿,有的部位同时出现充血和水肿,临床出现肾上腺皮质功能不全的表现。实验研究表明,补充适量的糖皮质激素可以降低脓毒血症动物的死亡率。 2 维生素D 与脓毒症的关系 作为一种调节钙磷代谢的维生素,维生素D 被证实可以作用于免疫调节、内分泌系统以及血液系统疾病。维生素D 由食物中摄取及皮肤内的7 脱氢胆固醇在特定波长的紫外线作用下合成。由外界吸收或合成的维生素D3依次在肝脏( CYP27A) 及肾脏( CYP27B) 内经过2 次羟化作用最终形成1 25 二羟基维生素D31 25( OH) 2D3]及25羟基维生素D325( OH) 2D3]。125( OH) 2D3又称为“活性维生素D”,1 25( OH) 2D3作用于维生素D 受体,维生素D 通过内分泌、自分泌/旁分泌、免疫调节及信号转导等多种途径发挥生理作用。25( OH) 2D31 25( OH)2D3更为稳定,临床上普遍接受维生素D 的评价指标是25 ( OH) 2D3。研究表明危重患者维生素D 缺乏的发生率高达70. 8% 98 8%。健康人群中,缺少维生素D 在一定时期内并不会产生明显不良后果。然而,近年已有研究表明,危重患者的病死率增加与维生素D 缺乏正相关。在巨噬细胞以及激活的T 淋巴细胞、B 淋巴细胞中VD 均有表达,对免疫系统有调节作用。有报道指出一些自身免疫性疾病与维生素D 缺乏与存在相关性。脓毒症患者血清25( OH)2D3水平的系统评价进一步证明,25 ( OH) 2D3浓度< 50 nmol /L 可能增加脓毒症患者30 天死亡率。在美国19792003 年之间前瞻性研究中,观察到的季节变化与败血症发生率的关系,冬季脓毒血症患者明显增加,可能与维生素D 的季节变化有关。 3 维生素D 与肾上腺皮质轴 下丘脑- 垂体- 肾上腺皮质轴( HPA) 作为神经内分泌系统的典型代表,其构成是由下丘脑视旁核细胞,脑垂体前叶,肾上腺皮质这三个部分通过各种激素相互调节与反馈而建立起来的一种复杂系统。其调节作用比较广泛,涵盖了生殖系统等多个组织系统,同时对于人体内环境的稳定以及人体的生长发育都具有非常重要的调节作用,并且是人体内支配肾上腺皮质激素的最重要途径。肾上腺皮质可以调节包括水盐平衡,血糖代谢等人体基本生命活动,而这些都是通过分泌多种类固醇激素来完成的。肾上腺皮质分泌的类固醇激素大致分为三种: 包括盐皮质急速、糖皮质急速以及部分性激素,这些类固醇类激素都是以胆固醇为原料在肾上腺皮质的P450 酶家族如CYP17CYP19CYP21 等催化生成。 目前已有较多证据表明HPA 轴与维生素D 间存在一定相关性。肾上腺皮质功能减退模型大鼠发现,糖皮质激素可能干预人体内维生素D 的激活反应,低剂量糖皮质激素可以促进维生素D 激活,而高剂量糖皮质激素反而会抑制维生素D 转变为其活性形式。同时体内维生素D 水平与原发醛固酮增多症( PHA) 有较大关联,其机制可能为通过肾上腺皮质产生作用,虽然关于维生素D PHA抑制还是促进部分结果存在矛盾。动物实验发现,雌性大鼠与牛的肾上腺皮质细胞CYP27B CYP21 基因具有高表达,而这两个基因均与体内维生素D 的活化代谢有关。敲除小鼠1α 羟化酶基因,发现小鼠下丘脑- 垂体分泌功能下降,同时抗利尿激素( ADH) 表达下调,提示下丘脑- 垂体轴的分泌受到维生素D 水平影响。维生素D 受体( VD) 在肾上腺皮质细胞中也是存在的,活化形式的维生素D 可以直接与之结合,进一步提示肾上腺皮质部分功能可能受到维生素D 轴的调控。 4 黄芪多糖在脓毒症中的干预作用 脓毒症大鼠模型,探讨黄芪多糖与核因子NF κβ 和细胞免疫的关系,认为包括黄芪多糖在内的多种组分可抑制脓毒血症模型大鼠NF κβ 的活化及调节TNF α 的表达,并可上调Th1 /Th2 型细胞因子及CD4+ /CD8+的比值,能有效抑制脓毒症大鼠的炎症反应,同时增强脓毒症大鼠的免疫应答。黄芪多糖可能保护T2DM 合并脓毒症大鼠胰腺线粒体氧化应激带来的损伤。有研究显示黄芪多糖可以通过对脓毒症尾期的免疫抑制状态产生干预作用来改善脓毒症的预后,且其机制可能与DC 细胞有关。同时另有动物实验发现黄芪多糖还可能通过降低MDAICAM 1 的水平以及抑制Caspase 3 的表达来改善脓毒症的并发症。提示黄芪多糖可以对脓毒症产生干预,但其具体机制尚不明确。 研究表明黄芪具有调节维生素D 轴的作用,黄芪多糖具有调节肾上腺皮质的功能,据此提出黄芪多糖具有作用于维生素D 轴,调节肾上腺皮质功能的作用。 运用ARROWSMITH 在线工具,发现黄芪与维生素D之间在骨发育、肿瘤、代谢综合征、糖尿病等多方面出现的关联文献篇数较多。通过文献词汇关联分析,推测它们之间或许包含一些未被发现的理论可能。现代药理研究证实黄芪未含类维生素D 成分。据此课题组提出假说,黄芪可能作用于维生素D 轴,并经过初步实验进行验证。黄芪可以增强肾上腺皮质轴的功能,对血清皮质醇的上调,改善Th1 Th2 型细胞因子的平衡,从而调节了NEI 网络的紊乱。由此提出黄芪多糖通过维生素D 轴对脓毒症大鼠肾上腺皮质起到保护作用,改善脓毒症预后的分子机制假说。基于以上认识,拟进一步设计在体和离体实验,观察黄芪多糖所产生的效应,明确黄芪多糖保护脓毒症大鼠肾上腺皮质的机制。为中医药对脓毒症的治疗提供新的研究途径。
  • [资讯] 2018年我国西药类产品外贸形势分析
    2018年,在全球经济复苏放缓、外需增长动力不足、全球贸易摩擦加剧的背景下,国际医药市场处于低速增长期。伴随新一轮经济结构调整以及供给侧改革,我国医药领域新旧动能转换却处于加速之际,创新驱动能力进一步增强,外贸结构持续优化,质量效益稳步提升。在内生动力的强大支撑下,我国西药类产品外贸整体仍呈现平稳向好的发展态势。 1 出口量价齐升,进口量增价减 2018年,我国西药类产品进出口额达632.87亿美元,同比2017年(下同)下降8.83%。其中,出口额为368.83亿美元,同比增长4.03%,继续保持了良好的增长态势,进口额为264.04亿美元,同比下降22.26%,对外贸易顺差为104.78亿美元。 西药类产品出口量价齐升,出口量同比增长2.41%,出口均价同比增长1.58%,出口额稳中有进;与之相对的,西药类产品进口量增价减,进口量同比增长7.88%, 进口均价同比下降27.93%。尽管进口均价大幅下跌拖累进口额出现负增长,但国内需求依旧旺盛,西药类产品进口规模持续增长。进口均价的显著下跌主要得益于近期我国为了保障百姓用药的可及性和可负担性而采取了一系列降低药价的政策措施,如进口药品零关税、降低抗癌药进口环节增值税税负、加快对国内抗癌药、孤儿药等临床亟需用药加快审评审批、医保目录药品谈判、“4+7”带量采购等。在政策合力的影响下,进口药价终于显著降低,惠及民生。 2 原料药出口占比八成,西药制剂出口比重提升 2018年,我国西药类产品3大类别的出口格局未发生明显变化。原料药依旧是出口主力军,出口量为929.72万t,同比增长3.75%,出口均价同比微跌0.53%,在此作用下,出口额达300.48亿美元,同比增长3.2%,在西药类产品出口总额中占比高达81.47%。维生素类、氨基酸类、青霉素类、解热镇痛类、头孢菌素类等大宗原料药的出口增幅在2017年显著增长的基础上再次突破两位数。而其他抗感染类、激素类原料药则在经历前期大幅增长后出口规模出现明显萎缩,拖累出口额显著下跌。由此可看出,原料药出口已基本结束了普涨行情,部分商品进入下行周期。 西药制剂出口规模同比下降5.22%,但出口均价却同比大幅上涨了25.17%。在此作用下,西药制剂出口额再创新高,达到41亿美元,同比增长18.64%,在西药类产品出口总额中占比达11.12%,同比提高了1.37个百分点。值得关注的是,越来越多的本土企业对欧、美、日等法规市场实现西药制剂规模化出口,且增长势头稳健,制剂国际化进程持续深化。 生化药出口亦呈现出量跌价升的态势,但出口均价17.17%的同比增幅未能抵消出口量19.02%的降幅,出口额同比下降了5.13%,达27.35亿美元,占西药类产品出口总额的7.42%。其中,酶和辅酶类制品出口规模的显著下跌是拖累生化药出口负增长的主要因素,而生化药出口第一大品种肝素及其盐出口实现量价齐升,且增幅显著,在此作用下,出口额同比大幅增长了40.04%,达11.03亿美元。 3 西药制剂进口占半壁江山,原料药进口需求增加 进口方面,西药制剂仍为主要进口类别。我国进口的西药制剂主要是跨国药企的专利药和原研药,在很长一段时期,即使专利到期,由于一品双规的招标采购政策导致进口药的价格依旧维持高位,国产药也很难与之形成充分竞争。随着仿制药质量一致性评价全面推进以及近2年医保目录价格谈判、近期“4+7”带量采购等一系列降低药价的政策措施合力刺激下,2018年,我国西药制剂进口均价终于大幅下跌,同比下降达25.36%。与此同时,尽管国家对抗癌药、罕见病等临床亟需用药也出台了一系列进口鼓励政策,但受药品注册上市周期的限制以及在国产药加速进口替代和跨国药企主动调整在华销售策略的影响下,西药制剂进口规模并未大幅增长,增幅仅为1.75%。在此作用下,进口额达130.3亿美元,同比下降了24.05%。近年来,受环保压力和部分原料药垄断影响,原料药频繁出现断供或价格猛涨的问题,为此下游企业逐步寻求进口替代;仿制药一致性评价和越来越多的新药国内外上市申请也扩大了对高质量原料药的需求,2018年,我国原料药进口规模同比增长了8.68%,但进口均价同比下跌了9.06%。受此影响,进口额同比微降了1.16%,达86.21亿美元,在西药类产品进口总额中的占比为32.65%。 在经历了近10年的高速增长后,2018年生化药进口额首现负增长,且在进口规模同比下降7.67%和进口均价大跌36.32%的双重拉动下,进口额同比大幅下降了41.21%,仅为47.53亿美元。其中,免疫制品、其他抗血清及其他血份、未列明的酶及酶制品的进口降幅明显。但人用疫苗、其他胰岛素及其盐等产品仍保持了较高的进口增幅。 4 出口市场需求稳定,进口市场价格普降 2018年,我国西药类产品向6大洲的出口额均实现正增长。亚洲、欧洲和北美洲依旧是我国主要出口市场,出口额分别为161.36 亿美元、103.34亿美元和53.97亿美元,合计出口额占比高达86.4%,对此3大洲出口量、价均呈现小幅增长态势。新兴市场方面,对拉丁美洲和大洋洲的出口量、价亦均温和增长;对非洲尽管出口量同比增长了9.52%,但出口均价却同比下降了8.28%。 从出口国别来看,2018年,我国西药类产品共出口到197个国家或地区。其中,对前10大贸易伙伴出口了近6成西药类产品,除对荷兰出口额小幅下跌外,对其他前10大贸易伙伴全部实现正增长。美国蝉联我国西药类产品第一出口贸易伙伴。尽管中美贸易摩擦不断升级,但美国对我国进口商品实施加征关税的清单并未涉及西药类产品,对我国西药类产品出口影响有限。2018年我国对美西药类产品出口量平价升,出口数量同比微降0.1%,出口均价同比上涨7.21%,在此作用下,出口额同比增长7.1%,市场份额达13.8%。印度尾随美国之后,依旧是我国西药类产品第2大出口贸易伙伴,市场份额占12.99%,出口量价均基本保持了2017年水平,出口额同比微增了1.62%。 “一带一路”沿线国家是我国西药类产品出口市场的重要组成部分,2018 年对其出口额为124.91亿美元,同比增长1.1%,占西药类产品出口总额的33.87%。其中,对菲律宾、波兰、斯洛文尼亚、沙特阿拉伯等主要市场出口增幅超过10%。 在国内为降低药价出台了一系列政策措施的刺激下,2018年,我国西药类产品自6大洲的进口均价均呈现了两位数的负增长,但进口规模变化不尽相同。欧洲作为我国西药类产品最主要的进口来源地,进口额占比达66.32%,自欧洲进口总体呈现量平价跌的态势;亚洲为我西药类产品进口第2大来源市场,占总进口额的16.92%,进口规模同比增长了13.94%;北美洲作为第3大西药类产品进口来源市场,占总进口额的11.84%,进口量却同比出现15.16%的负增长;拉丁美洲、大洋洲和非洲尽管进口额占比较低,但自该3大洲进口规模均显著增长。 2018年,我国共从99个国家或地区进口了西药类产品,但主要进口仍集中自欧、美、日等制药发达国家或地区。前10大进口贸易伙伴依次为德国、美国、法国、爱尔兰、意大利、日本、丹麦、瑞典、英国和瑞士,合计进口额占总进口额的比例达74.39%。其中,自德国、法国、爱尔兰、意大利和英国的进口呈现量升价减的态势;自丹麦和瑞士的进口则量减价升;自美国、日本和瑞士的进口量价双降。此外,自波多黎各、印度、马来西亚、印度尼西亚等国家的进口增幅显著,进口规模和进口额均呈现两位数增长。 5 民营企业是出口主力军,三资企业进口优势明显 2018年,我国共有12872家企业经营西药类产品出口业务,同比增加了378家。民营企业依旧占据了我西药类产品出口主力军的地位,占比达82%的民营企业出口了61%的西药类产品,出口额同比增长7.79%。三资企业的表现亦较为突出,占比近13%的三资企业完成了27%的西药类产品出口业绩。国有企业的活力继续减退,仅剩645家国有企业经营西药类产品出口,同比减少了34家,实现西药类产品出口额同比下降1.91%。 与经营西药类产品出口企业不断增长的趋势相同,我国从事西药类产品进口业务的企业亦在逐年递增。2018年,企业数同比增加了近百家,已达7655家。从企业性质上看,三资企业在西药类产品进口领域优势明显,公司数占比达42%的三资企业进口额占比高达67.01%;民营企业也表现出较强的发展活力,公司数已达3971家,同比增加140家,实现进口额占比达20.61%,同比提高2.59个百分点;国有企业仅存436家,实现进口额占比12.34%。 6 机会与挑战并存,2019年西药类产品外贸形势展望 当前世界经济稳步扩张,主要经济体市场需求保持增长态势,全球贸易有望延续复苏态势。但受全球范围贸易摩擦加剧、主要发达经济体货币政策收紧、地缘政治紧张局势升温等影响,世界经济下行风险增大。在此复杂严峻的外部环境下,我国西药类产品外贸仍将面临外部需求增幅有限、市场竞争激烈、贸易摩擦加剧、出口监管趋严等挑战。除此外,环保持续投入、原材料、用工等成本不断增加、汇率波动风险也在不断削弱我国出口产品的国际竞争力。 尽管我国西药类产品外贸存在困难和挑战,但也面临着诸多机会与利好。近年来,我国西药类产品企业不断苦练内功,在国际注册认证、研发、国际市场营销以及全球范围内的资源整合能力持续提升;国务院及有关主管部门各项稳外贸、促增长措施逐步得到落实,外贸企业营商环境进一步优化;中国药品质量和监管政策与国际进一步接轨,以及“一带一路”政策深入推进等因素都将对我西药外贸发展提供有利支撑。此外,随着国内推动药品可及性、可负担性的一系列政策举措进一步落地,我国进口药价仍可能继续回落,但随着需求的不断释放,西药类产品进口规模有望逐渐增长。 综上,我国西药类产品外贸仍将奋力前行。考虑到进口均价仍有下降空间,预计2019年西药类产品出口增速将高于进口增速,全年进出口额实现温和增长。
  • [资讯] 独活寄生汤联合胫骨高位截骨在膝关节骨性关节炎治疗中的应用研究
    膝骨关节病临床发病率高,多见于中老年患者。膝关节骨性关节炎的治疗方法多样,在膝骨关节炎“阶梯”治疗方法中,胫骨高位截骨术(High tibial osteotomyHTO)相对有效。中医治疗膝关节骨性关节病近年逐渐得到临床骨科医生的关注。膝关节骨性关节炎属于中医“膝痹”范畴,临床多以肝肾亏虚证出现,表现为膝部疼痛、内翻畸形、活动受限等。膝关节骨性关节炎若不能得到有效的治疗与控制,则会严重影响患者的生命健康及生活质量。通过胫骨高位截骨,改善下肢力线,将膝关节内侧压力部分转移至外侧,从而达到缓解膝关节内侧压力,从而减轻疼痛,缓解关节炎症状。自1958 HTO 手术用于治疗膝关节骨性关节炎以来,并发症逐渐减少。除手术治疗膝关节骨性关节炎外,药物治疗同样在临床中多见。但西药常存在不良反应多、排异等弊端从而影响疗效。临床实践中,本院骨伤科采用独活寄生汤加减治疗膝关节骨性关节病的过程中,得到较好疗效。故本研究将独活寄生汤联合胫骨高位截骨治疗膝骨关节病进行了研究总结。 1 资料与方法 1.1 临床资料 选取本院骨伤科2016 10 月至2018 10月收治26 例膝关节骨性关节炎患者为研究对象。按照随机数字表法随机分为对照组和观察组,各13 例。其中均为单膝,均为内侧膝部疼痛为重,男12 例,女14 例;年龄4258岁,平均(46.6±8.9)岁;患者病程14 年,平均病程(2.3±1.2)年。对照组中男6 例,女7 例;患者病程14 年,平均病程(2.1±1.5)年;年龄4257 岁,平均(45.7±9.9)岁。观察组中男6 例,女7 例;病程14 年,平均病程(2.2±1.6)年;年龄4258 岁,平均(46.6±7.9)岁。对照组和观察组的两组患者在年龄、性别、病程等临床资料方面差异无统计学意义,存在有可比性。 1.2 纳入及排除标准 纳入标准:①符合膝骨关节炎诊断标准(ACR);②存在临床临床症状;③自愿签署知情同意书;④通过伦理委员会批准通过。排除标准:①合并风湿免疫类疾病;②合并危及生命的原发病;③合并局部皮肤破损及感染;④存在明显外伤史并有影像学支持韧带、半月板、骨质的损伤;⑤合并精神类疾病及无法配合治疗者;⑥无法进行完研究者及因任何理由退出者。 1.3 治疗方法 对照组按规范治疗方案,行胫骨高位截骨治疗,并术后进行常规康复锻炼。 观察组在对照组治疗的基础上,术前术后配合应用独活寄生汤治疗。其中方药:桂枝9 g、当归9 g、杜仲12 g、白芍12 g、茯苓12 g、延胡索12 g、甘草6 g、川芎6 g、独活10 g、熟地黄10 g、防风10 g、秦艽10 g、牛膝15 g、党参18 g、细辛3 g、桑寄生30 g。水煎,早晚分服,术前10 d,术后10 d 1.4 观察指标 ①疼痛评分(VAS),治疗前后分别统计观察组对照组的疼痛评分;②膝关节功能评分(HSS),治疗前后分别统计观察组及对照组膝关节功能评分,反应膝关节功能情况;③生活质量评分(SF-36),治疗前后统计观察组及对照组该评分,分数越高代表生活质量越好。 1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计软件进行数据统计分析,计数资料以[n%]表示,组间比较采用χ2检验;计量资料采用“`χ±s”表示,组间比较采用t 检验;以P0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 对照组与观察组VAS 评分对比 治疗前,对照组和观察组的VAS 评分分别为(6.12±1.31)和(5.98±1.43),差异无统计学意义;治疗后,对照组和观察组的VAS评分分别为(4.12±1.22)和(2.12±1.02),两者差异有统计学意义(P0.05)。即治疗后,观察组VAS评分小于对照组,见表1 2.2 对照组与观察组HSS 评分 治疗前,对照组和观察组的HSS评分分别为(47.21±6.31)和(48.18±4.21),差异无统计学意义;治疗后,对照组和观察组的HSS 评分分别为(72.10±8.12)和(89.12±7.02),两者差异有统计学意义(P0.05)。治疗后,观察组HSS评分大于对照组HSS评分,见表2 2.3 对照组与观察组SF-36 评分对比 观察组患者SF-36的评分显著高于对照组,差异有统计学意义(P0.05),见表3 3 讨论 膝关节骨性关节炎临床发病率高,尤其多见于老年人。若膝关节骨性关节炎不能得到及时有效的治疗,将会严重影响患者的生活质量。近年来,随着膝关节骨性关节炎“阶梯”治疗的研究以及“保膝”理念的逐渐成熟,1958 Jackson 提出的HTO 治疗膝关节骨性关节炎的治疗方法越来越多被报道,并且随着内固定及手术技术的不断发展,HTO 的并发症逐渐减少,这都为临床开展HTO 奠定了基础。 除了手术方法治疗膝关节骨性关节炎外,药物也在治疗该疾病的过程中起到了一定作用。常见的西药治疗,存在病程长、机体排异、不良反应多等缺点。随着我国中医药不断的发展,中医中药治疗膝关节骨性关节炎在临床中取得了一定的疗效。 膝关节骨性关节病属于中医“痹症”范畴,中医理念中有“肝主筋,肾主骨”,该病恰为人体肝肾亏虚,从而筋骨失养,筋骨失养合并风寒湿侵袭人体,从而人体气血不畅,迁延致膝部,从而出现膝关节疼痛。故治疗上应给予滋补肝肾,强筋健骨治疗。独活寄生汤中,应用防风、秦艽祛风;独活、细辛温通经脉;牛膝、桑寄生滋补肝肾,强健筋骨;当归、熟地、川芎、白芍共行活血养血之功;加以甘草、党参、茯苓以补气健脾。此方滋补肝肾、强筋健骨、养血通络,在临床上取得良好疗效。 综上所述,独活寄生汤联合胫骨高位截骨治疗膝关节骨性关节炎可明显减轻术后患者的VAS 评分,缓解患者膝关节疼痛。该联合治疗方案同样在改善膝关节活动功能方面存在显著优势,可改善患者膝关节活动度。通过本研究的治疗方案,可改善患者生活质量。独活寄生汤联合胫骨高位截骨治疗膝关节骨性关节炎值得临床推广应用。
  • [资讯] 高敏心肌肌钙蛋白T 在新生儿疾病中的临床应用进展
    近十年来,心肌肌钙蛋白(cardiac troponin,cTn)作为心肌损伤标记物被认为是诊断急性心肌坏死(AMI)的金标准。随着检测技术的不断提高,高敏心肌肌钙蛋白Thigh-sensitivity cardiactroponin T, hs-cTnT)检测在成人心肌损伤的诊断中占主导地位,美国于2017 年首次批准了hs-cTnT检测的使用。学者们发现血清hs-cTnT 水平升高不仅见于明确的心肌坏死,而且还可见于无坏死或者可逆性心肌损伤,对心肌损伤类疾病的发生和预后有一定的评估和预测作用。新生儿是一个特殊群体,在围生期各种生理过程变化导致很多检验指标并不能像成人那样被较好地利用。为了进一步探索hs-cTnT 在新生儿疾病中的应用价值,本文对肌钙蛋白的生物学特性、生理学机制、作为心肌损伤生物标志物在新生儿疾病中的临床应用进行综述。 1 cTn 及其生物学特性 1.1 概述 随着对横纹肌收缩机制的深入研究,1965年学者Ebashi Kodama 发现了cTn1973 Greaser 等对肌钙蛋白不同亚基的生理作用进行阐述,继而带来cTn 分析技术并在临床上广泛应用。2007 年以来cTn 检测成为诊断AMI 的金标准,而不再推荐使用肌酸激酶同工酶MBCK-MB)进行诊断。基于cTn 的释放动力学,在一定时间、动态监测cTn 水平变化在诊断AMI 中至关重要。 1.2 cTn 生物学特性 Greaser 等于1973 年里程碑式的研究介绍了肌钙蛋白亚基的命名并沿用至今。他们发现兔子的肌钙蛋白有4 个主要片段。通过重组实验发现正常肌钙蛋白活性部分为234 片段:片段224 kDa)是当Ca2+ 缺乏时,抑制Mg2+ 依赖的肌动蛋白ATP 酶的活性,因此命名为TnI;片段337 kDa)与原肌球蛋白结合,因此命名为TnTTnT 是原肌球蛋白(位于细肌丝上)和肌钙蛋白复合物之间的连接装置;片段420 kDa)是Ca2+ 结合单元,因此被命名为TnCTnC 调节细丝的活化。 1.3 cTn 的特殊性 任何用于检测心脏病理损伤的生物标志物都需具有高特异性和敏感性。TnI TnT 作为肌钙蛋白的亚单位分别有心脏(cTnI/cTnT)和骨骼肌(sTnI/sTnT)亚型;但是没有发现TnC 的心脏亚型,而慢收缩骨骼肌TnC 亚型(slow-twitch skeletalmuscle TnC, ssTnC)同时存在于心肌和骨骼肌中。为了避免混淆,文献中经常将心肌中的ssTnC 称为cTnC,其实两者无本质区别。在健康、发育完全的心脏中,cTnIcTnT c/ssTnC 联合表达。某些TnI TnT 亚型的表达受发育调控,他们的表达水平在生后被下调,通常称其为“胎儿型亚型”。这些胎儿型亚型在某些病理条件下可在出生后重新表达。 在胚胎和胎儿发育过程中,慢收缩骨骼肌TnI亚型(slow-twitch skeletal muscle TnI, ssTnI 替代cTnI 只在心脏中表达。随着胎儿型亚型表达下调,在出生后89 个月转化为cTnI。而cTnT 的情况更为复杂。cTnT 的独特之处在于其4 种不同亚型是通过选择性剪接产生的(cTnT 14),其中cTnT3是正常成人心脏的主要亚型,衰竭心脏中cTnT2表达明显高于cTnT3cTnT 检测的是所有cTnT 亚型,并不能反映对于心衰结果的判断。另外,患病骨骼肌已被证明在极少数情况下可重新表达胎儿型TnT,从而导致假阳性。 正常的心功能依赖于3 个肌钙蛋白亚单位的表达。这是由活体小鼠基因敲除模型的例子来证明的。敲除小鼠胚胎中的cTnT 基因可导致肌节解体和早期胚胎死亡;敲除小鼠胚胎中的cTnI 基因在产后15 d 内对健康没有影响,归因于ssTnI 补偿了cTnI 的缺失。随着ssTnI 表达的下调,小鼠在第18 天死于TnI 缺乏性急性心力衰竭。没有关于cTnC 基因敲除的文献报道(推测它的敲除将是致命性的)。 2 血清cTn 检测 cTn 检测氨基酸序列的差异使得cTnI/cTnT的定量检测成为可能。大多数是基于夹层原理的非竞争性酶联免疫吸附法(ELISA),利用抗体的高特异性和亲和力进行检测。心肌细胞缺血在15 min 内死亡,组织学证据显示在46 h 内出现坏死。cTn 在缺血后数小时即可在血中被检测到。随着肌纤维的不断溶解,cTn 可以持续升高长达2 周,有很长的诊断窗口期。AMI cTnT 主要以自由形式和T : I : C 三元复合物形式出现在血液中,而cTnI主要以I : C 二元复合物的形式出现;所有形式的肌钙蛋白都可以进行氧化还原修饰,以氧化或还原的形式存在,且不影响检测的准确性。 有关cTn 释放动力学的研究显示:一般来说,任何蛋白质的释放速度取决于其在细胞内的位置、分子量及局部的血液和淋巴液流动。有学者发现cTnT 释放谱是双相的。研究者认为AMI 血清cTn 的浓度分布可由胞浆池释放导致初始峰值,结构池释放(降解的收缩结构)可使其水平持续升高。而cTnI 缺乏初期峰值,被认为是单相释放的。有文献指出当心肌细胞损伤而不是坏死时释放的cTnT 是从胞浆池中释放的。 3 cTn 释放的病理生理机制 cTn 是器官特异性的,不是疾病特异性的。cTnI/cTnT 对心肌损伤的高心肌特异性和临床敏感性是公认的。从广义上讲,cTn 升高有6 种主要生理机制:心肌细胞坏死、细胞凋亡、正常心肌细胞周期、蛋白水解降解产物的细胞释放、细胞壁通透性增加、膜泡的形成和释放。 然而,无论是cTnI 还是cTnT 都不仅由于心肌梗死而释放,它们可以因为缺血、非缺血和心外疾病继发引起心肌损伤而释放。cTn 升高的潜在病理机制包括:容量和/ 或压力超负荷(如急性和慢性心力衰竭、肺栓塞、肺动脉高压)导致左或右心室心肌应变增加,左或右心室肥厚(如动脉或肺动脉高压、主动脉狭窄),因需氧量增加而引起的心肌坏死(如房室性快速心律失常、败血症),冠状动脉灌注减少(高危肺栓塞、脓毒性休克或出血性休克、心动过速和心动过缓),弥漫性血管内凝血(如败血症),炎症性浸润引起的心肌坏死(如心肌炎、心包炎),肾素血管紧张素醛固酮系统激活引起的心肌细胞凋亡增加,交感神经过度刺激、炎症激活,以及其他可能的触发因素(如慢性心力衰竭)、cTn 的肾清除减少(如慢性肾病)和胸廓创伤(如心挫伤)等等。国外文献显示急慢性疾病均可引起肌钙蛋白升高。cTn 浓度与心血管疾病风险和全因病死率之间关系密切,循环cTn 水平越高,病死率越高。 4 新生儿hs-cTnT 的参考范围 hs-cTnT 的出现使得一些临床疾病早期发生和预后评估成为可能。hs-cTnT 是预测不良心脏事件预后的有力指标。美国心脏病学会和欧洲心脏病学会推荐成人测量cTnT 水平(>99th 解释为心肌局部缺血)来诊断急性冠脉综合征和急性心肌梗死。随着技术的进步,肌钙蛋白检测的新时代已经开始。在心肌损伤2 h 内血中hs-cTnT水平即有升高且具有更高敏感性(比常规cTn 检测敏感410 倍)。然而,新生儿这一特殊群体即便在心血管状态正常时,常规的cTnT/cTnI 浓度也可能处于较高水平。目前在新生儿疾病领域,很多数据资料都来源于对cTnI/cTnT 的研究,而hs-cTnT 检测使用甚少。故下边引用资料部分是对cTnT 的研究。 由于各种原因导致心肌细胞的直接损伤、应力的改变、缺氧损伤及耗氧增加均可使hs-cTnT 升高。这些同样可以成为解释新生儿时期cTn 升高的一系列病理生理原因。应该如何正确解释血清hs-cTnT 水平升高是一个热门话题。到目前为止对于新生儿和婴儿hs-cTnT 生理浓度和阈值数据的研究较少,近期国外有报道:对241 例健康新生儿采集脐带血或静脉血标本,采用电化学发光免疫分析法检测hs-cTnT 浓度以确定健康新生儿中hs-cTnT 分布。结果显示:hs-cTnT 的中位浓度为38.2 ng/L(四分位间距为31.348.0 ng/L);hs-cTnT 参考范围的下限和上限分别为20.1 ng/L95%CI15.321.8 ng/L 83.0 ng/L95%CI74.1106.9 ng/L);后者是97.5 th 所达到的水平;hs-cTnT 血浆浓度在6 个月以内降至成人水平;该研究证实新生儿和婴幼儿的hs-cTnT 参考水平高于成人。溶血、年龄等多种心外因素均可影响hscTnT水平。新生儿经剖腹产与阴道分娩相比[35.028.543.4ng/L vs. 38.932.648.4ng/L]hscTnT水平差异有统计学意义(P=0.0084),考虑阴道分娩过程中存在生理压力和短暂缺氧的影响。有研究健康成人在剧烈运动后cTnT 水平升高可间接说明阴道分娩婴儿hs-cTnT 水平偏高的原因。该研究提出另一个导致健康新生儿hs-cTnT 浓度升高的原因:开始自发呼吸使肺动脉阻力降低导致右心室后负荷减少,在出生后1 个月内优势由右心室转移到左心室这一生理过程可能导致心肌结构细微变化,从而可释放少量肌钙蛋白进入循环。另外,溶血会对hs-cTnT 测定有负性干扰。据报道hs-cTnT 浓度显著下降,可能由于溶血导致诊断试剂盒中使用的TnT 表位被破坏,从而影响hs-cTnT检测水平。作者提醒在使用这一正常值时应考虑多种心外影响因素。 5 新生儿hs-cTnT 临床应用 5.1 hs-cTnT 与心肌损伤 新生儿期心肌损伤多见于宫内/ 外重症感染、心力衰竭、缺血缺氧、药物毒性等,hs-cTnT可以结合临床判断新生儿心肌损伤程度。由于以往没有hs-cTnT 正常值,所以一直不能独立作为评价心肌损伤的标志物。 有文献指出:当围产期窒息缺氧时,hscTnT检测优于CK-MB,前者升高见于由于各种原因引起的心肌损伤,而后者并不特异,其升高可以发生在心肌损伤及肾损伤时。Correale 等发现严重窒息婴儿在出生后24 h cTnT 水平显著高于Ⅰ级和Ⅱ级窒息的健康新生儿。低射血分数<60% 的窒息婴儿血清cTnT 12 h24 h 显著高于正常射血分数者。充血性心力衰竭窒息患儿在出生后48 h 内血清cTnT 浓度明显高于非充血性心力衰竭患儿。死亡的窒息婴儿在出生后48 h 内血清cTnT 浓度明显高于存活婴儿。 极低出生体重(ELBW)儿心肌损伤是常见的,而这种损伤是这一弱势群体低血压的主要原因。Cruz 等对27 名体重在500999 g 之间的ELBW儿进行研究,发现ELBW cTnT 水平明显高于健康新生儿和成人;推测胎龄越小,细胞凋亡和cTnT 释放率越高,但研究没有数据支持早产儿和血清cTnT 浓度之间的直接关系。在ELBW 儿心肌细胞膜受损,细胞内蛋白渗漏被认为是导致cTnT浓度升高的唯一机制。 5.2 hs-cTnT 与动脉导管未闭 近些年hs-cTnT 诊断和评估早产儿动脉导管未闭(patent ductus arteriosus, PDA 领域的研究逐渐增多。有证据表明,具有血流动力学意义的PDAhemodynamically significant patent ductusarteriosus, hsPDA)尤其是在舒张压极低的情况下,对冠状动脉血流有负面影响,可能导致心肌缺血,导致hs-cTnT 水平升高并高于非hsPDA 患儿,且与多项超声心动图参数呈正相关。虽然hs-cTnT作为hsPDA 早期诊断的唯一生物标志物的预测作用有限。但其可能是对hsPDA 综合评估的最佳组成部分,该评估包括超声心动图和其他生物标志物如氨基末端B 型脑钠肽前体(N terminal-proBtypenatriuretic peptide, NT-proBNP)等。Asrani 等研究胎龄<34 周或者体重<1 500 g 新生儿,诊断hsPDA 时,hs-cTnT AUC 值为0.718cutoff 值为170 pg/mL),敏感度和特异度分别为70% 55%NT-proBNP AUC 值为0.905cutoff 值为3 460 pg/mL),敏感度和特异度分别为88% 72% 显示NT-proBNP 对于诊断hsPDA 优于hscTnT。证实hs-cTnT 可以作为hsPDA 的辅助诊断指标(图1)。有文献提示:PDA 患儿接受布洛芬或手术结扎治疗48 hPDA cTnT 水平明显高于自发关闭组;治疗成功后,cTnT 水平显著降低;cTnT 水平与导管直径、左房- 主动脉直径比、降主动脉舒张末期速度显著相关;cTnT 水平升高可能反映PDA 对心肌的潜在损害。 5.3 hs-cTnT 与新生儿呼吸窘迫综合征 目前hs-cTnT 与新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)关系的研究不多,对cTnT 研究显示[38]:新生儿心功能受呼吸窘迫的严重程度及其通气处理的影响。病例组和健康婴儿之间cTnT 浓度有显著差异。病例组中合并低血压、或需呼吸支持、或死亡的婴儿,其cTnT 水平均高于该组其他婴儿。cTnT 水平与新生儿呼吸支持时间呈正相关。故cTnT 可以是新生儿心脏和呼吸功能障碍的早期标志物。有证据证明[20] NRDS 早产儿心内膜下缺血是心功能障碍的主要原因,缺血即会导致心肌损伤,这就可以解释NRDS 患儿cTnT 水平始终较高。 5.4 脐血中的cTn 检测 在出生时脐血TnT 浓度经常很高,而TnI 在出生时大多检测不到。这些心脏调节蛋白来源于新生儿,不受母体水平的影响。脐带cTnI 显著升高是缺氧缺血性脑病严重程度和足月婴儿病死率的良好早期预测指标,Türker 等研究cTnI 预测缺氧缺血性脑病病死率的ROC 值为0.956(标准误为0.02895%CI0.91.011P<0.0001);CK-MB ROC 值为0.847 标准误为0.04795%CI0.7560.939P=0.001);CK ROC 值为0.835(标准误为0.06995%CI0.7010.969P=0.001)。脐血中的cTnT 水平不受胎龄、出生体重、性别或分娩方式的影响。呼吸窘迫患儿脐血cTnT水平明显升高,提示cTnT 可能是新生儿心肌损伤的有用标志物。 综上所述,hs-cTnT 在成人预测和评估不良心血管事件中具有较好的临床应用价值。由于新生儿群体的特殊性,hs-cTnT 在新生儿疾病中的应用较局限,临床资料甚少。近期有研究提出新生儿和小婴儿hs-cTnT 正常值,这是临床工作者的福音,可以作为临床参考。该研究作者也提出应该注意其他影响检测hs-cTnT 的因素,小心使用其正常值。有研究显示NT-proBNP 是心衰指标,其水平与hs-cTnT 并无相关性。笔者也曾有368 例新生儿临床数据显示:早期新生儿hs-cTnT NTproBNP无相关性(r=-0.04547P=0.4879), 而晚期新生儿两者则有明显的相关性(r=0.43617P<0.0001),说明hs-cTnT NT-proBNP 在新生儿早期均受到更多围产因素的影响,出生1 周后它们之间良好的相关性可以为临床提供更多的诊疗依据。hs-cTnT 具有较高的心肌损伤特异性,如果进行动态监测、结合其他生化指标如NT-proBNP,以及超声心动图结果,相信一定能够更全面了解新生儿心脏功能及受损情况。

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