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  • [资讯] 谷氨酰胺在神经系统疾病的临床应用研究进展
    摘要:谷氨酰胺为肠道外营养组成部分,是人体的一种条件必需氨基酸,也是体内最丰富的氨基酸,广泛存在于脑、骨骼肌和血液中,被证明是目前所知的最重要的氨基酸。谷氨酰胺的生理作用广泛,包括增加蛋白质的合成、减少肌肉分解,改善胃肠道黏膜的屏障功能,减少过度的炎症反应,保护肝脏、增强免疫系统功能,缓解疼痛、抗疲劳、抗抑郁,促进伤口愈合等。谷氨酰胺是脑脊液中含量最多的氨基酸,是兴奋性氨基酸谷氨酸和抑制性氨基酸γ-氨基丁酸( GABA) 这两种重要神经递质的前体物质,同时由氨基酸组成的蛋白质又是许多重要物质的转运体,因此认为谷氨酰胺对多种中枢系统的功能比如抑郁、愤怒以及疼痛具有调节作用。近年对谷氨酰胺的研究呈现日益增多的趋势,本文查阅近年来国内外相关的研究文献,拟对谷氨酰胺在神经系统的临床应用作一综述,为其临床合理应用提供参考依据。 1 谷氨酰胺影响神经系统功能的生理学基础 谷氨酰胺是一种特殊的营养物质,在肌肉蛋白质和血浆蛋白质中含量分别约为75% 和26%。谷氨酰胺是唯一含2 个氮原子的氨基酸,转运近三分之一的氨基酸和氮,同时谷氨酰胺也是核苷酸合成的必需物质以及蛋白质合成与分解的调节物。谷胱甘肽系统是减轻氧化应激的主要机制之一,谷氨酰胺则是谷胱甘肽的前体,谷胱甘肽的合成离不开谷氨酰胺,谷氨酰胺在许多部位向谷胱甘肽提供足够的谷氨酸来源,在损伤或缺血时保证谷胱甘肽正常水平。在脑内,谷氨酰胺参与氨和多余谷氨酸毒性的消除,并使谷氨酸保持正常水平。释放到突触间隙的谷氨酸完成作用后,被神经胶质细胞摄取,再在谷氨酰胺合成酶的作用下转变为谷氨酰胺,重新运回神经元,保持神经元内较高含量的谷胱甘肽,清除自由基,为神经元提供抗氧化保护。谷氨酰胺是谷氨酸和GABA 的前体,谷氨酸是兴奋性神经递质,其过度增加会引起神经元和其他细胞如少突胶质细胞的损伤,GABA 是神经系统内主要的抑制性递质,普遍存在于中枢神经系统,运动功能与之密不可分。正常生理情况下,两种递质保持平衡状态,在神经系统中二者一旦失衡,会造成各种与神经系统相关的病理反应。 2 谷氨酰胺在神经系统中的临床应用 2. 1 谷氨酰胺用于缓解疼痛 产生疼痛感觉是神经系统的重要功能,一系列的动物研究表明,谷氨酰胺对实验动物有镇疼的作用,应用标准评估技术对痛觉进行评估,发现在减少疼痛刺激反应时间方面,谷氨酰胺的止痛效果与苯丁唑酮类似。 Zunhammer 等学者在一项横断面研究中,探讨了人类大脑中谷氨酸和GABA 水平与疼痛敏感性之间的关系,该研究使用点分辨光谱法测量结合谷氨酰胺/谷氨酰胺水平,GABA 水平的测量采用GABA 编辑光谱; 应用线性回归分析表明,通过疼痛相关脑区聚集的结合谷氨酰胺/谷氨酰胺水平与疼痛敏感性呈正相关,而与GABA 无明显关系。如前所述,谷氨酰胺通过调节疼痛相关脑区聚集的结合谷氨酰胺/谷氨酰胺水平,降低疼痛敏感性,达到缓解疼痛目的。 Ruggiero 等学者研究了纤维肌痛综合征患者血清中游离氨基酸的浓度变化,研究结果表明,与健康对照组相比,纤维肌痛综合征患者的某些游离氨基酸存在失衡状态。正常人体内血浆氨基酸浓度的维持,依赖于内源性氨基酸代谢池的释放和各组织之间对氨基酸的利用所达到的动态平衡。谷氨酰胺是人体血浆和组织中最丰富的游离氨基酸,约占总游离氨基酸的50%,可以推测,谷氨酰胺可以通过氨基酸代谢池的调节,使失衡的游离氨基酸回归平衡状态,从而缓解纤维肌痛综合征患者的疼痛症状。 头颈癌患者接受化学放射治疗后,口腔、咽和喉部严重黏膜炎的发生率较高,导致疼痛和生活质量受损,并且往往导致治疗中断。Tsujimoto 等学者研究探讨了L-谷氨酰胺对化学放射治疗所致口腔、咽、喉黏膜炎的影响,这项双盲、随机、安慰剂对照试验包括40 例未经治疗的鼻咽癌、口咽癌、下咽癌或喉癌患者,随机分为口服L-谷氨酰胺或安慰剂治疗,在整个化学放射治疗过程中,每天3 次,每次10 g; 使用国家癌症研究所不良事件通用术语标准3. 0 版评估黏膜炎情况,谷氨酰胺显著降低了第4、5和6 周的最大黏膜炎分级和疼痛评分; 故谷氨酰胺能显著降低由化学放射治疗诱导的头颈癌患者口腔、咽和喉黏膜炎的严重程度,并减少患者的疼痛感。Pattanayak 等也研究了谷氨酰胺对口咽癌患者放化疗后黏膜炎的影响,结果表明接受谷氨酰胺治疗患者的黏膜炎发作和严重程度明显延迟,所有接受谷氨酰胺治疗的患者均未出现G3 期黏膜炎,疼痛感明显减轻。 2. 2 谷氨酰胺用于抑郁治疗 谷氨酰胺能够维持抑郁患者的正常神经精神症状。有研究表明,谷氨酰胺有明显的抗抑郁作用,对抑郁患者每日给予小剂量谷氨酰胺( 250 mg /d) ,可以使患者达到“维持生命所必需的”精神情绪状态。Yüksel 和Ongür对9 项有关抑郁症的研究进行荟萃分析,发现其中6 项研究报道抑郁症患者前额叶、海马、杏仁核的谷氨酰胺水平下降; Horn 等学者通过研究也认为,伴有神经性厌食的抑郁症患者前扣带回谷氨酰胺水平下降,其中扣带回前膝部的谷氨酰胺变化与患者汉密尔顿抑郁量表评分呈负相关。因此由以上研究可以看出,抑郁症患者大脑内部存在谷氨酰胺水平的下降。 Son 等学者通过研究抑郁小鼠的内侧前额叶皮质中谷氨酸和谷氨酰胺的水平变化发现,慢性应激引起的抑郁行为是由于内侧前额叶皮质中谷氨酸能神经元活性的低下,而谷氨酸能神经元的活性与谷氨酸和谷氨酰胺水平成正相关。通过补充外源性谷氨酰胺可增加谷氨酸能神经传递,从而起到抗抑郁作用。石苗和李中钦考察了谷氨酰胺对焦虑和抑郁情绪致妇科肿瘤患者细胞免疫功能低下的影响,该研究观察了139 例妇科肿瘤患者,按数字随机法将患者分为对照组和观察组,2 组均接受择期肿瘤切除术,术后当天至1 周内给予常规肠道营养支持,观察组在常规治疗基础上加用丙氨酰谷氨酰胺,持续治疗1 个月; 结果发现,观察组焦虑自评量表、汉密尔顿抑郁自评量表评分改善明显,CD3 +、CD4 + 和CD4 + /CD8 + 升高明显。结果表明,谷氨酰胺可直接改善妇科肿瘤患者焦虑和抑郁症状,也可以通过提高细胞免疫功能起到改善肿瘤患者焦虑和抑郁症状的目的。 2. 3 谷氨酰胺有利于有机磷中毒患者的神经功能改善 在我国有机磷农药在农业种植中使用普遍,使其造成中毒的危险性升高。据报道,我国每年的中毒患者中约70%为有机磷中毒,患者的乙酰胆碱酯酶与有机磷农药的磷酰基相结合而导致水解乙酰胆碱的能力减弱或丧失,引起体内乙酰胆碱蓄积,造成神经传导功能障碍,从而导致中毒症状。重症有机磷中毒患者,易合并多器官、系统功能损伤,其中包括神经系统。近年有研究发现,谷氨酰胺有利于改善有机磷中毒患者的神经功能受损状况。 蔡景润和陈伟雄探讨了不同剂量丙胺酰谷氨酰胺治疗对重症有机磷中毒患者神经功能的改善作用,将105 例重症有机磷中毒患者随机分为A组、B 组和对照组。对照组予以阿托品、氯解磷定、血液灌流及其他对症处理,A、B 组在对照组基础上加用丙氨酰谷氨酰胺,A 组剂量2. 0 ml /kg,B 组剂量1. 5 ml /kg,1 /d,连续3 d; 比较3 组中毒症状消失时间、呼吸机脱机时间、住院时间、全血胆碱酯酶活性恢复时间、腓总神经的运动神经传导速度、感觉神经传导速度等指标。A、B 组中毒症状消失时间、呼吸机脱机时间、住院时间、全血胆碱酯酶活性恢复时间均显著短于对照组; A 组治疗后5 d 的腓总神经的运动神经传导速度、感觉神经传导速度显著高于B 组和对照组,且B 组显著高于对照组。由此可见谷氨酰胺可缩短有机磷中毒患者的中毒症状消失时间、呼吸机脱机时间及住院时间,且大剂量( 2 ml /kg) 应用可进一步改善神经功能。 2. 4 谷氨酰胺对大脑的保护作用 在发生组织缺氧、缺血、损伤等应激反应时,体内可发生脂质过氧化反应产生大量自由基,自由基会对神经细胞产生损伤。在脑内,谷氨酰胺既可使谷氨酸保持在正常水平,又可在谷氨酰胺合成酶的作用下合成谷氨酰胺,从而保证合成谷胱甘肽的原料充足,以保持神经元内较高含量的谷胱甘肽,清除活性氧,为神经元提供抗氧化保护。有研究发现,谷氨酰胺联合高压氧组创伤性颅脑损伤患者的神经功能及神经细胞凋亡水平明显低于普通肠内营养组和单独使用谷氨酰胺或高压氧组,表明谷氨酰胺联合高压氧对创伤性颅脑损伤有改善作用。谷氨酰胺作为氨基酸、核酸、蛋白质的复合底物,不仅能够改善患者营养水平,降低脂质过氧化反应,减少氧自由基,而且还能通过刺激免疫细胞产生免疫调节作用,增强机体抗感染能力,最终改善患者预后。 有学者对谷氨酰胺用于新生儿缺氧缺血性脑病的治疗进行研究,结果发现,加用谷氨酰胺组脑水肿消失时间明显短于常规治疗组,且血清神经元特异性烯醇化酶值也明显低于常规治疗组。因此,将谷氨酰胺用于新生儿缺氧缺血性脑病的早期治疗,不仅可以减轻急性期患儿的脑水肿,而且有利于神经元细胞的修复,有效改善缺氧造成的脑损伤。 2. 5 用于认知功能障碍患者的早期诊断 有学者通过检测正常老年脑和认知功能障碍患者前扣带回皮质及右侧海马谷氨酸- 谷氨酰胺和GABA 含量变化发现,正常老年对照组在前扣带回皮质及右侧海马区的谷氨酸- 谷氨酰胺/肌酐比值和GABA/肌酐比值均较正常青年对照组降低,正常老年对照组、轻度认知功能障碍组和阿尔茨海默病组中,阿尔茨海默病组的前扣带回皮质区谷氨酸- 谷氨酰胺/肌酐比值较正常老年对照组和轻度认知功能障碍组降低; 阿尔茨海默病组右侧海马区谷氨酸- 谷氨酰胺/肌酐比值较正常老年对照组降低; 由此可知正常老年脑内谷氨酸- 谷氨酰胺、GABA 含量可同时降低,而阿尔茨海默病患者脑内谷氨酸- 谷氨酰胺降低更明显,这一现象为阿尔茨海默病患者的早期诊断提供依据。 3 结语 谷氨酰胺是一种条件必需氨基酸,是血液中含量最多的游离氨基酸,也是脑脊液中含量最多的氨基酸,细胞外谷氨酰胺被神经元吸收,触发谷氨酸的突触释放,然后被星形胶质细胞吸收,再转化为谷氨酰胺。这种反馈回路会持续地激发网络活动。谷氨酰胺可有效减轻疼痛症状,改善抑郁状态,维持正常神经精神状态; 同时也可以降低脂质过氧化反应,减少自由基,为神经系统提供抗氧化保护。也有研究表明,对智力不全的儿童尝试用谷氨酰胺治疗发现,与对照组比较,谷氨酰胺能增加弱智儿童的智商。虽然谷氨酰胺对大脑和其他神经系统作用方面的信息还不是很全面,但一系列的研究结果无疑是令人鼓舞的,谷氨酰胺价格相对低廉,不良反应小,对神经系统相关的反应有很重要的调节作用,随着研究的进一步深入,谷氨酰胺在临床的应用值得期待。
  • [资讯] 炙甘草汤临床应用研究进展
    摘要:炙甘草汤最早见于张仲景《伤寒论》,原文“伤寒,脉结代,心动悸,炙甘草汤主之”。在《金匮要略·血痹虚劳病脉证并治第六》中以《千金翼》炙甘草汤论述,“治虚劳不足”。《金匮要略·肺痿肺痈咳嗽上气病脉证治第七》中以《外台》炙甘草汤论述,“治肺痿涎唾多,心中温温液液者”。该方由炙甘草、生姜、桂枝、人参、生地黄、阿胶、麦门冬、麻仁、大枣组成,诸药合用,补气养血,调和阴阳。临床上常用于治疗心血管疾病,对于其他系统的疾病也有所应用。现将对炙甘草的临床应用及现代药理研究进行综述。 1 分类 1. 1 心律失常 1. 1. 1 临床应用 应飞等对炙甘草汤治疗缓慢性心律失常的临床研究文献进行了系统评价,纳入研究文献7 篇,均为随机对照研究,共619 例患者。结果表明,对于治疗缓慢性心律失常的治疗,炙甘草汤在提高心率、改善症状方面优于阿托品,且不良反应少。杜明远等对炙甘草汤治疗室性期前收缩的临床研究文献进行了Meta 分析,最终纳入随机对照试验文献17 篇,共1 405 例病例。结果表明,炙甘草汤与常规抗心律失常药物( 胺碘酮、美西律、心律平、倍他乐克) 相比,对室性期前收缩患者室早次数的减少、临床症状、中医症状的改善效果更好,且不良反应少。 1. 1. 2 实验室研究 动物实验显示炙甘草汤对缺血及再灌注、过敏、药物、离子紊乱诱发的心律失常有效。连晓媛等发现炙甘草汤可以降低急性心肌缺血诱发的大鼠模型室早、室速及心律失常的总发生率; 张晓云等研究发现,缺血缺氧可以改变豚鼠左心室流出道的自律性,炙甘草汤可以拮抗左心室流出道慢反应自律细胞的异常电信号,起到抗心律失常的作用。炙甘草汤注射液静脉注射可以减低健康、“阴虚”小鼠心律失常的程度,且“阴虚”小鼠更明显; 对“血虚” “脾虚”动物模型的心律失常,炙甘草汤具有同样作用。炙甘草汤可以拮抗过组胺等过敏递质诱发的触发性心律失常,对乌头碱、氯化钙诱发的室性心律失常,电解质紊乱如低钾、低镁诱发的心律失常也有作用。 1. 1. 3 机制探讨 心肌细胞上存在多个相互作用、维持正常电活动的离子通道,若某种通道功能、数目发生异常,则可能诱发心律失常,其中起主要作用的通道,也是抗心律失常药物的最佳靶点。心肌细胞上钙通道包括ICa-L和ICa-L ( L 型和T 型钙) ,ICa-L对动作电位影响小,ICa-L作为平台期内向电流的主要成分,是钙通道阻滞剂的作用靶点。钙内流发生变化,细胞内钙含量增加,正向钠/钙交换增强,易发生早后除极电位触发活性,随着钠离子含量的增加,反向促进钠/钙交换,发生晚后除极电位,所以钙或钠通道阻滞剂都可以作用于触发性心律失常。研究发现炙甘草汤含药血清可抑制兔心肌细胞抑制ICa-L,发挥抗心律失常的作用。瞬间外向钾( Ito)通道是心肌细胞膜上重要的K + 通道,其分布密度从心内膜到心外膜递增,这种解剖学上的分布易产生跨壁复极差异、形成折返微环路,诱发2 相折返室性心律失常。研究发现炙甘草汤含药血清可以抑制Ito发挥抗心律失常的作用。I 类抗心律失常药物作用于心肌细胞的Na + 通道,长期使用有致心律失常的作用。炙甘草汤应用于心律失常不良反应少,其机制可能与对INa用无明显影响有关。 1. 2 心力衰竭 1. 2. 1 临床应用 炙甘草汤应用于心律失常的患者在临床治疗中十分常见,王志萍观察发现扩张型心肌病心力衰竭患者治疗加用炙甘草汤,疗效较单纯西药更好。杨红亚和杨宽观察基础治疗加炙甘草汤治疗慢性心力衰竭患者发现,患者的生命质量得到改善。敖丽丽和李炫谕观察发现炙甘草汤联合地高辛对慢性心力衰竭患者的治疗效果更好。心力衰竭是心血管疾病的晚期状态,一方面心力衰竭可能合并多种心律失常,另一方面心律失常不仅是心力衰竭的重要诱因,也是心力衰竭患者死亡风险增加的因素。心力衰竭时发生心律失常的机制尚不明确,心脏结构变化引起的折返是室性心律失常的结构基础; 离子通道、调节蛋白等“致心律失常重构”是电生理基础。抗心律失常药物常具有负性肌力、致心律失常的作用,因此心力衰竭患者在选用时应该慎重。中医强调整体观、标本兼治,炙甘草汤复方多作用于多靶点,可以为心力衰竭患者合并心律失常提供新思路。 1. 2. 2 机制探讨 组织金属蛋白酶抑制剂( TIMPs) 包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 和TIMP-9,是抑制基质金属蛋白酶( MMPs) 活性的一组多功能因子。心室重构作为心力衰竭发展过程中基本病理机制,与MMPs、TIMPs 关系密切。MMPs 与TIMPs 处于动态平衡之中,MMPS 表达的增强及TIMPs 作用的减弱在心肌重构过程中发挥了重要作用。由于MMPS 在心力衰竭患者体内表达增强,通过测定MMPS 的含量及活性可以间接反映患者心室重构的状态。张志刚和芮素芳通过比较炙甘草汤与真武汤发现,炙甘草汤可以降低MMP-9、增加TIMP-1,对心率、血压、心排量等血流动力学指标也有改善作用,提示炙甘草汤在慢性心力衰竭患者的治疗中有积极的一面。炙甘草汤改善心肌纤维化的作用在心房颤动新西兰兔模型中也有体现。 1. 3 保护心肌 1. 3. 1 临床应用 《难经·十四难》云: “损其心者,调其荣卫”。炙甘草汤中炙甘草、人参、生姜、大枣合用补益中焦,使气血有化生之源,气血足则心脉养。因此炙甘草汤在治疗病毒性心肌炎方面也有不错的疗效。张红新观察发现病毒性心肌炎常规治疗的基础上加用炙甘草汤,对降低心肌酶、改善心电图的效果更显著。 1. 3. 2 机制探讨 邝志斌对慢性病毒性心肌炎的小鼠模型进行了观察,发现炙甘草汤组小鼠心肌组织纤维化程度低、细胞凋亡少。王智和徐瑞鑫观察结扎冠脉的心肌缺血大鼠模型发现炙甘草汤可以降低血清中肌酸激酶( CK) 、乳酸脱氢酶( LDH) 的浓度,发挥保护心肌的作用。陈兰英等同样发现炙甘草汤可以降低心肌酶指标,并且发现炙甘草汤可以使气血两虚证大鼠模型的炎性反应指标超敏C反应蛋白( hs-CRP) 、炎性反应递质( IL-2、TNF-α) 升高,提示炙甘草汤保护心肌细胞的作用可能是通过增强免疫功能发挥的。炙甘草汤可以增加活性氧( ROS) 活性,减低超氧化物歧化酶( SOD) 、丙二醛( MDA) 含量,增强大鼠心肌抗氧化的能力,减轻氧化自由基对心肌的损害,发挥保护心肌的作用。 1. 4 造血功能 唐容川在《血证论》中把炙甘草汤誉为“生血之源,导血之流,真补血之第一方”,炙甘草汤也常应用于气血亏虚的患者。红系爆式集落形成单位( BFU-E) 在造血细胞研究中是重要参考指标,研究发现添加炙甘草汤细胞培养上清可以促进BFU-E 中的细胞增长,提示炙甘草汤可能通过刺激细胞因子发挥生血作用。转化生长因子-β1 ( TGF-β1) 是维持干细胞储存的关键生理因子,低浓度的TGF-β1对未成熟造血干细胞的诱导具有可逆作用,不会诱导细胞凋亡,并且还能防止未成熟造血干细胞标志物黏液样蛋白( CD34) 丢失。粒细胞集落刺激因子( G-CSF) 本是促进粒细胞增殖的细胞因子,近年研究发现具有动员外周造血干细胞的作用。马鹏等观察发现炙甘草汤具有刺激生血的作用,可能与促进TGF-β1和G-CSF 的分泌有关。另有研究发现炙甘草汤对促血小板生成素( TPO) 也具有刺激作用。 1. 5 肿瘤 肿瘤是人体阴阳失衡的一种病理状态,肿瘤的治疗存在较大的不良反应,对人体阴阳是进一步的损害。张景岳言“善补阳者,必于阴中求阳,则阳得阴助而生化无穷; 善补阴者,必于阳中求阴,则阴得阳升而泉源不竭”。炙甘草汤方中既有生地黄、麦冬、阿胶这种补阴药,又有少量桂枝温通阳气,阴阳并调。炙甘草汤可以降低蒽环类药物产生的心肌损伤。炙甘草汤可以改善肿瘤化疗后的生命质量,减轻化疗的不良反应。化疗会发生骨髓抑制,影响造血功能,导致白细胞数目减少、严重贫血、血小板降低,进而诱发感染、大出血等。动物实验研究发现,炙甘草汤可能通过促进骨髓造血细胞中人抗增殖细胞核抗原( Ki-67) 和抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表达,抑制促凋亡因子Caspase、Bax 蛋白的表达,对骨髓抑制小鼠的造血功能产生恢复效应。恶性肿瘤化疗后胃肠道功能紊乱的情况在临床中十分常见。炙甘草汤应用于化疗后的患者,可以有效缓解患者症状。 2 小结 综上所述,炙甘草汤可能是作用于离子通道产生抗心律失常的作用,并可以保护心肌、延缓心肌重构。炙甘草汤重用生地黄,佐以阿胶、麦冬,滋阴养血力量强; 现代药理研究也证实了炙甘草汤可以促进造血功能造血。另外炙甘草汤还可以改善化疗患者的症状,减轻化疗的不良反应。 3 讨论 随着研究的深入,对于炙甘草汤的理解不能在局限于“心动悸、脉结代”,而应发挥中医整体观的思想,“异病同治”。比如现代社会节奏快、压力大,有研究将关注度放在亚健康状态的慢性疲劳综合征上,发现炙甘草汤可以改善动物模型的疲劳症状。虽然目前对于炙甘草汤的临床报道很多,但研究的质量普遍较低,在盲法、对照、疗效评价指标方面都有不严谨的地方,希望会有越来越多的高质量、大样本研究的出现,让经典方剂发光发热。
  • [资讯] 无缝隙护理在阿司匹林联合瑞替普酶治疗心肌梗死的应用研究
    摘要:心肌梗死是常见心血管疾病的一种,主要由冠状动脉狭窄或闭塞所致,此病发生后,患者心肌血液供应减少或中断,需及时对闭塞血管进行再通,使心肌血液供应恢复。近年来,临床上多通过阿司匹林联合瑞替普酶的方案对心肌梗死进行治疗,可使闭塞血管迅速再通,并对血小板聚集产生抑制作用,进而达到改善患者病情的作用,但对护理配合的要求较高。心肌梗死患者在接受阿司匹林联合瑞替普酶治疗的同时,护理效果直接影响患者疗效,然而心肌梗死患者病情严重,常规护理措施已无法满足患者病情需求。无缝隙护理是指患者治疗前、治疗中、治疗后的全程护理,强调为患者提供一体化、全面化的护理服务。本文探讨无缝隙护理在阿司匹林联合瑞替普酶治疗心肌梗死的应用。 1 资料与方法 1.1 一般资料 收集本院2017年6月至2019年1月阿司匹林联合瑞替普酶治疗的心肌梗死患者198例,分为对照组和试验组,每组99例。对照组男51例,女48例;年龄45~76岁,平均(60.52±4.57)岁;病程0.7~4.5h,平均(2.39±0.10)h;下壁梗死41例,前间壁与广泛前壁梗死34例,高侧壁梗死24例。试验组男52例,女47例;年龄44~76岁,平均(60.13±4.68)岁;病程0.6~4.7h,平均(2.41±0.11)h;下壁梗死40例,前间壁与广泛前壁梗死36例,高侧壁梗死23例。纳入标准:(1)参照《急性心肌梗死诊断和治疗指南》确诊;(2)耐受阿司匹林联合瑞替普酶治疗;(3)自愿参与研究并签署知情同意书。排除标准:(1)合并其他严重器官、系统疾病;(2)认知、精神、交流障碍;(3)无法配合完成研究。本研究经医院伦理委员会审批。两组患者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有对比性。 1.2 方法 1.2.1 治疗方法 两组均予以阿司匹林联合瑞替普酶治疗。阿司匹林(拜耳医药保健有限公司,J20130078)首次剂量为300mg,口服,1次/天,随后降低剂量为150mg,持续7d。瑞替普酶(爱德药业有限公司,S20030095)18mg静脉推注,30 min后再次予以18 mg静脉推注。 1.2.2 护理方法 对照组予以常规护理,主要包括用药护理、情绪安抚、观察病情等。试验组开展无缝隙护理:以科室护理人员结构为基础,组建专业无缝隙护理团队,明确成员工作职责,组织团队成员专业培训,培训内容包括心肌梗死专业知识、转归途径,以及无缝隙护理方法等,再依据以往阿司匹林联合瑞替普酶治疗心肌梗死的经验,结合心肌梗死护理进展,制订无缝隙护理工作流程,并制作和发放工作手册,使成员充分认识并熟练掌握各个护理工作流程,并将无缝隙护理措施应用于患者。(1)治疗前护理:患者入院后,尽快予以连接19导联心电图,并对生命体征密切监测。于患者同一侧肢体对两条以上静脉通道进行建立,予以预留针,常规采集血液标本,协助患者接受专业检查与治疗。指导患者绝对卧床休息,使心肌耗氧量得以有效控制,遵医嘱予以镇静药品,使其疼痛程度缓解。向患者介绍阿司匹林联合瑞替普酶方案的意义、注意事项及用药方法等内容,嘱咐其积极配合用药治疗的必要性,并予以情绪安抚。(2)治疗中护理:予以严密心电监护,开始注射药物时详细询问及了解患者感受,密切观察是否有再灌注心律失常现象出现,将患者情况及时报予医生,对于存在不适症状者,配合医生予以专业处理。予以全程病情观察,观察是否存在心源性休克、低血压、心脏骤停等不良反应,若有异常情况出现,及时与医生联系。同时,对患者牙龈、皮肤与口腔黏膜等容易出血的部位密切观察,选择套管针进行输液以控制穿刺次数,必要时还可对穿刺部位进行10min按压。(3)治疗后护理:与患者亲切交流,以温柔语气予以安慰、鼓励,介绍恢复良好的相似病例,使其配合度、信心提升。指导家属为患者准备盐、脂肪含量低的清淡易消化类食品,以半流质或流质为主。指导患者急性期通过进食蜂蜜水、石蜡油等方式促进排便,恢复期通过食用粗纤维食物以保持大便通畅度,严重情况下可遵医嘱予以缓泻剂、开塞露等干预。患者病情恢复且已达到出院标准时,予以出院指导,介绍病情恢复过程中需要注意的各个事项,并发放心肌梗死疾病健康教育册,定期予以随访。 1.2.3 观察指标 (1)自我效能与配合度:治疗前、治疗后,分别通过一般自我效能评价量表(GSES)、治疗依从性(Frankl量表)评价两组自我效能与依从性。GSES包括10项内容,采用4级评分,得分越高则说明患者自我效能感越强。Frankl总分4分,1分为拒绝、痛苦,2分为不合作、不情愿,3分为使用、冷淡,4分为主动合作享受。评分越高,代表治疗依从性越好。(2)不良反应:统计两组消化道出血、低血压、牙龈出血、室颤、心脏骤停等不良反应发生情况。(3)疗效:治疗前、治疗后,分别采集静脉血液标本4mL,常规离心后采用酶联免疫吸附法对高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、脂联素(APn)、淀粉样蛋白A(SAA)进行测定。 1.3 统计学处理 采用SPSS20.0统计软件进行分析,计量资料以`x±s表示,采用t 检验;计数资料以率表示,采用χ检验。以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 自我效能与依从性 治疗前,两组GSES、Frankl评分差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,以上评分均升高,且试验组较高,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。 2.2 不良反应 试验组不良反应发生率3.06%,低于对照组的11.22%,差异有统计学意义(χ=4.923,P<0.05),见表2。 2.3 临床疗效 治疗前,两组患者HMGB1、APn、SAA差异无统计学意义(P >0.05);治疗后,两组患者HMGB1、SAA均降低,APn均升高,且试验组变化更明显,差异有统计学意义(P<0.05),见表3。 3 讨论 心肌梗死起病急、病情凶险,需及时予以救治,救治的关键主要为对闭塞的冠状动脉进行再通,使心肌灌注恢复。阿司匹林具有良好的抗血小板、抗炎等作用,不但可促进闭塞冠状动脉再通,而且可使血小板聚集减少。瑞替普酶是纤溶酶原激活物的一种,是当前溶栓常用治疗药物之一,可快速开通闭塞的冠状动脉。当前,阿司匹林联合瑞替普酶的方案逐渐被应用于心肌梗死治疗中,但此治疗方案相关不良反应较多,加之心肌梗死病情紧急,需要医护之间做到高质量的协作。 无缝隙护理通过治疗前、治疗中、治疗后的护理,可有效提升治疗安全性及效果。有研究对老年冠心病患者展开无缝隙护理,发现护理后患者心绞痛发作次数明显减少,病情明显缓解。本研究发现,试验组GSES、Frankl评分较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),提示相较于常规护理,无缝隙护理能提升阿司匹林联合瑞替普酶治疗的心肌梗死患者自我效能、依从性。心肌梗死发病后,患者会有胸闷、胸痛、濒死感等症状出现,致使其产生恐惧、焦虑等情绪,自我效能及配合度均下降。通过治疗前、治疗中、治疗后的无缝隙护理,在注重各环节心理干预的基础上,对患者不良情绪进行充分缓解,使其自我效能提升,从而积极配合诊疗工作及护理活动。近年多项研究表明,以阿司匹林联合瑞替普酶治疗心肌梗死患者时,可能会有出血、低血压、室颤等不良反应出现,致使临床疗效受影响。为了降低不良反应,本研究通过无缝隙护理,治疗前强调重视病情监测、合理配置药物,治疗中强调规范给药,治疗后加强用药观察,在规范患者治疗工作的基础上,完善护理流程,从而实现对不良反应的有效预防目标。 HMGB1在人体体内细胞中大量存在,细胞受损时HMGB1会大量释放并进入血液,因此临床将该指标用于反映心肌细胞损伤与炎症情况。SAA 是急性识相反应蛋白的一种,可反映心肌梗死情况。APn是肽类激素的一种,来源于脂肪细胞组织,是稳定斑块的重要指标,具有抗炎作用。心肌梗死患者受病情影响,其HMGB1、APn、SAA 水平均会出现异常,以HMGB1、SAA异常升高及APn降低为主要表现。在阿司匹林联合瑞替普酶治疗的基础上,给予无缝隙护理,通过改善患者自我效能及提升其配合度,可增强其治疗信心,加之可有效控制不良反应,因此还能进一步缓解患者病情,提升其治疗效果。除此以外,无缝隙护理工作中,通过对患者开展治疗后的饮食、排便、出院等护理,可促进病情转归,从而有效降低HMGB1、SAA,提升APn,促进患者康复。 综上所述,对接受阿司匹林联合瑞替普酶治疗的心肌梗死患者开展无缝隙护理可有效提升自我效能、配合度,减少不良反应,进而提升疗效。但此次研究存在样本量小、观察时间短等不足,需进一步研究。
  • [资讯] 探讨阿奇霉素治疗小儿呼吸道感染治疗中的应用研究
    摘要:小儿呼吸道感染是临床常见的呼吸科疾病,临床症状主要表现为头痛、咳嗽、体温升高等症状,如不及时进行治疗容易出现急性肺炎以及支气管的病变,对患儿身心健康产生极大威胁与伤害。因此,针对患儿呼吸道感染选用更恰当有效的治疗药物显得格外关键。本文通过我院2018年7月~2019年7月收治的呼吸道感染治疗的98例小儿患者为研究对象,探讨阿奇霉素用于小儿呼吸道感染的临床用药价值,现具体报告如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料 选取我院2018年7月~2019年7月收治的呼吸道感染治疗小儿患者98例,应用双盲法随机数字分组分为实验组与对照组,各49例。实验组中男26例,女23例,年龄1~10岁,平均年龄(4.96±0.72)岁;参照组中男25例,女24例,年龄2~9岁,平均年龄(4.32±0.88)岁。两组患儿一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。 1.2 方法 对照组选用阿莫西林克拉维酸钾予以治疗:给药剂量为30mg/kg,溶于100mL的0.9%氯化钠中,静脉滴注半小时,1天2次,连续用药1周。 观察组选用阿奇霉素予以治疗:给药剂量为10mg/kg,溶于100mL的0.9%氯化钠中,静脉滴注半小时,1天1次,连续用药1周。 1.3 观察指标 (1)对两组患儿治疗有效率评价标准:显效,患者临床症状基本完全消失,身体其他指标均恢复正常;有效;呼吸道感染症状得到缓解,其它指标基本恢复;无效,患者临床症状没有的到改善,反而有加重的迹象。 (2)对比两组患儿用药后不良反应率对比,并进行有效评价。 1.4 统计学分析 本次数据分析软件选择SPSS16.0。相关计量资料以均数±标准差(`x±s)表示,且观察组与对照组数据比较采用t检验;以百分比、频数表示计数资料,采用χ检验组间数据。P<0.05表示差异具有统计学意义。 2 结果 实验组治疗总有效率87.75%,高于对照组79.59%;实验组不良反应率8.16%,低于对照组18.36%,均具有统计学意义(P<0.05),见表1。 3 讨论 在治疗小儿呼吸道感染常规用药主要以青霉素类药物为主,例如阿莫西林克拉维酸钾等药物,然而长期服用此类药物容易出现病原菌耐药性,从而极大的影响治疗效果。阿奇霉素是一种新型的大环内酯类药物,其特点主要有:抗菌活性较强、范围较广并且在酸性环境中也能保持其药性稳定,对临床常见的呼吸道感染致病菌均有明显的抑制和杀灭作用。阿奇霉素主要通过抑制蛋白合成发挥治疗作用,药物进入人体后可以快速吸收,药物浓度高,同时药物半衰期可达48~56h,药效非常之持久,停药后数日体内药物浓度衰减幅度不大,仍具有治疗效果。本文研究结果表明,实验组患儿治疗有效率为87.75%,优于对照组的79.59,差异有统计学意义(P<0.05);实验组不良反应率为8.16%,低于对照组的18.36%,差异有统计学意义(P<0.05)。可见,阿奇霉素在小儿呼吸道感染的治疗中具有较高的应用意义。 综上所述,选用阿奇霉素为呼吸道感染患儿进行治疗不仅可以显著地提升疗效,并且可以减少患儿不良反应,因此对有必要将阿奇霉素推广应用于小儿呼吸道感染的治疗当中。
  • [资讯] 天津市生物医药产业创新发展对策研究
    摘要:0 引 言 生物医药产业作为我国重点发展的战略性新兴产业之一,是典型的创新驱动型高新技术产业,其发展对于推进健康中国,满足巨大的、未满足的临床治疗需求具有重要作用。在国家“供给侧结构性改革”的有力推动下,我国医药改革不断深化,带动了生物医药产业往创新方向前进。2019 年12 月以来,我国发生新型冠状病毒引起的肺炎疫情,对社会及各行各业造成了难以估量的损失,我国医药行业冲到疫情防控的最前线,在病毒检测、疾病诊断、临床救治药物开发、疫苗研发等方面发挥了至关重要的作用。目前,新冠病毒疫情在我国已经得到了有效控制。2020 年3 月11 日,世界卫生组织官宣新冠病毒进入全球大流行状态,多个国家出现疫情爆发的态势。疫情的发生对生物医药产业链的各个环节造成了巨大的冲击,催动各种传统模式转型提速,新模式也在不断完善之中。本文在研究我国生物医药产业发展的总体趋势和规律的基础上,系统分析天津市生物医药产业创新发展的现状并提出有针对性的建议,以期为其创新能力的提升提供政策启示。 1 天津市生物医药产业发展面临的国内外形势 1.1 我国生物医药产业面临结构性调整 自发生新冠疫情,从寻找病毒源头到毒株分离、核酸测序、诊断产品研发、治疗药物的开发到医疗检测设备应用,国产的医药产品在抗击疫情中起到关键作用,国家及地方政府积极推进疫情防治科技攻关项目,短时间内形成了一批新技术、新产品。在全球生物医药技术不断取得新突破的趋势下,我国医药产业形成了越来越多的创新产品。但目前,新药研发更多是针对慢性疾病和退行性疾病,医疗器械产业集中度低、创新能力弱,高端医疗装备主要依赖进口,针对突发急性传染病尤其是病毒性传染病进行医药研发的机构及企业较少。疫情后,我国医药产业将在急性传染病防治、智慧医疗、传统医药产业体系转型升级等领域迎来新的发展机遇。 1.2 监管环境不断改善 在医改政策的主导下,我国从医药的供给端、支付端及使用端进行了卓有成效的联动式改革,无不体现了政府对创新的支持,也极大地释放了医药企业创新的活力。MAH(药品上市许可持有人)制度扩大了医药产品创新的主体;药品集中采购将改变我国医药企业以仿制为主的局面,倒逼企业创新;医保目录纳入更多的创新药,创新回报机制不断完善;对创新药重新定义为“全球新”,回归了药品创新的本质。监管环境的逐步完善催生了一批创新产品,为公众的健康提供了保障,也推动我国生物医药产业进入了创新发展的黄金时代。 1.3 创新全球化的趋势加速升级 生物技术在药物应用领域中取得的突破促使制药业从“封闭式创新”向“开放式创新”模式转变。创新性的医药产品总是由国际大型医药企业进行集中化开发的模式已经改变,创新产品开发更多采用VIC 的轻资产模式,既“VC(风险投资)+IP(知识产权)+CRO(研发外包)”相结合的方式。创新主体更加多元化,创新型生物技术公司往往在某一领域具有独特的竞争优势,能够成功开发出创新性医药产品。更多的国内医药企业具有向跨国药企进行创新医药产品授权许可的能力,药企你中有我、我中有你的程度不断加深。 1.4 数字医疗科技在医药健康领域将获得更多应用 人工智能、5G、大数据等技术在病毒溯源、药物开发、医学诊疗、临床决策、物资调配等疫情防控工作中得到了广泛应用,并形成了较好的市场接受度及成熟的商业模式。国家各部委出台了鼓励人工智能、互联网诊疗服务应用于疫情防控的相关要求及倡议,各类数字医疗服务平台在应用中通过数据的积累而进行了不断的完善。疫情之后,我国将会更加支持数字医疗科技在医药健康领域中的大规模应用,这将推动数字医疗行业加快商业化进展,并整体提升医药健康产业的运行效率。 1.5 创新生态系统的完善让更多创新企业发展壮大 在国家多举措支持产业发展的政策背景下,我国生物医药产业基础科研能力不断提升,海外大批高层次人才回国创新创业。资本市场的青睐,对创新型生物技术公司进入港交所、上交所的制度支持,开放式创新平台服务能力的不断提升,推动我国生物医药产业创新生态系统的逐步完善。一家创业企业短短几年时间可以走出一条从初创、发展到上市的成功发展路径,百济神州、信达生物等代表我国生物医药产业新生力量的创新企业茁壮成长,证明了我国生物医药产业创新生态系统已经逐渐成熟,并将继续推动生物医药产业的高质量发展。 2 天津市生物医药产业发展现状 2.1 医药研发能力不断增强,在疫情防控中发挥重要作用 在这次新冠疫情防控中,对医药产品研发速度要求极高,对病患的救治需求极为迫切。得益于天津市生物医药产业的研发能力不断增强,各企业、研发机构的科研人员、一线人员夜以继日的连续奋战,在短时间内取得了诸多用于医疗诊断及救治的科研成果。由天津中医药大学校长张伯礼院士领衔的中医药团队在武汉江夏方舱医院以中医为主救治轻型、普通型病人方面发挥了巨大的作用,红日药业的独家品种血必净应用于重症患者抑制“炎性因子风暴”可截断病势发展为危重症,相比西药更安全有效且副作用小。高端人用疫苗开发领军企业康希诺与军事科学院医学研究院生物工程研究所共同开发的重组新型冠状病毒(2019-COV)疫苗(腺病毒载体)获批进入Ⅰ期临床试验,这是我国首款进入临床研究阶段的新冠候选疫苗。多家机构研发出新冠肺炎快速检测试剂盒,博奥赛斯、丹娜生物及一瑞生物的检测试剂盒获欧盟准入资格认证。 2.2 产业园区孵化能力不断提升,助推医药产业创新发展 天津生物医药产业布局,主要集中在滨海高新区、开发区和北辰经济技术开发区、武清经济技术开发区、西青经济技术开发区5 个园区,分布于天津市的东西两侧,形成了依托园区作为核心载体的模式,园区有各自发展特色。在中国生物技术发展中心发布的《2019 中国生物医药产业园区竞争力评价及分析报告》中,这5 个园区入围全国生物医药产业园区综合竞争力50 强,相比于2018 年进入50 强的园区增加1 家。各园区将生物医药产业作为发展的重要方向,以创新发展为驱动,不断推动生物医药产业聚集,不断完善产业生态,培育孵化了一批生物医药企业,产业创新能力不断提升。 2.3 创新能力提升引领天津向全国先进制造研发集群迈进 天津市不断加快全国先进制造研发基地建设,生物医药产业的产值保持良好的增长势头,产业结构不断优化,通过研发创新不断推动产业向价值链高端延伸。化学药、中药、生物制药、医疗器械领域是天津市重点发展的生物医药产业领域,近年来,已有多家企业成长为这些细分领域的龙头企业。康希诺作为创新型疫苗研发明星企业于2019 年在港股上市,是我国疫苗研发领域内第一家在港股上市的企业。赛诺医疗、丹娜生物等一批生物医药细分领域内的领军企业向龙头企业迈进。凯莱英、方恩等国内CRO/CMO服务外包领军企业极大地完善了生物医药创新的产业链。企业创新能力不断提升,将为天津今后在生物医药产业针对传染病防治、创新药、创新型医疗器械开发打下坚实基础。 2.4 产业链不断完善,构建“产学研”一体化生态体系 依托对生物医药产业平台、载体的不断建设及完善,天津市为生物医药产品的创新研发提供了重要支撑。在生物医药领域有国家级工程中心2 家,国家重点实验室5 家,国家临床医学研究中心3 家,国家级企业技术中心6 家。聚集了天津药物研究院、中科院工生所等一批高水平的创新研究平台。天津国际生物医药联合研究院、中英医疗健康产业基地等专业的生物医药孵化载体对于孵化中小型生物医药企业具有举足轻重的作用。初步构建了涵盖医药产品开发的早期发现、临床前研究、临床研究、上市审批等全产业链各环节的产业服务平台体系,形成了生物医药创新链条一体化的生态体系。 2.5 坚持创新驱动,产业政策体系不断完善 天津市出台了一系列生物医药产业政策,从顶层设计上指引产业的健康发展。市政府先后出台了《天津市生物医药产业发展三年行动计划(2018—2020 年)》《关于进一步支持本市生物医药产业高质量发展的若干意见》等政策,形成了多渠道、全方位支持产业发展的政策体系。疫情发生后,天津市出台了促进企业健康发展的各项措施,针对疫情影响下企业面临的实际困难精准施策,突出体现了人性化的特色。为应对疫情诊断、治疗的迫切问题,天津市出台了新冠病毒应急防治的专项项目,加大科技研发投入,带动医药企业科技创新发展“上台阶”。 3 天津市生物医药产业创新发展的对策与建议 2020 年,国家医保谈判、带量采购等政策全面落地,新冠疫情的发生使得生物医药产业面临更加严峻的内外部挑战。天津市要在深刻把握全球产业发展形势的基础上,在传染病防治领域重点布局并给予长期稳定的支持;同时以建设全国先进制造研发基地为目标,坚持研发创新,优化产业结构,聚焦前沿技术的引进与应用,不断融合产业链与创新链,推动生物医药产业链向全球中高端迈进。 3.1 重点布局新冠病毒等传染病防治领域 推动当前新冠疫情的研发成果尽快落地应用。在尊重科学规律的基础上,按照安全、有效的标准加快新冠病毒疫苗的研发。充分发挥中医药在疫情防控中的独特作用及优势,积极推广有效处方药和中成药,推动中医药用于疫情防控走向国际化。不断完善疾病检测方法,推动病毒诊断产品实现欧盟CE 认证等国际认证。鼓励开展针对新冠病毒治疗的“老药新用”、小分子化合物、抗体、细胞因子、RNA 疗法的相关研究。针对疫情防控关键核心技术进行攻关,不断完善传染病研究体系建设,大力引进及培养从事病毒研究的科研人员。 3.2 做好龙头企业及创新型中小企业的引育和孵化 在明确各功能区定位的基础上,科学规划产业布局,结合京津冀协同发展等战略机遇,主动对接全球医药500 强企业,对接全球创新资源,积极引进行业领军企业。不断壮大龙头企业,引导各种创新资源向龙头企业聚集,围绕龙头企业完善其配套的上下游产业链条。培育中小企业,对于初创期创新型企业,要加强服务及政策前置,呵护其成长,鼓励企业不断做大做强。支持企业建立研发中心、研发团队,不断提高自主创新能力。 3.3 不断完善生物医药产业链 鼓励企业开展创新药、高端仿制药、创新型医疗器械的研发,逐步淘汰已趋于市场饱和的低端仿制药、医疗器械的生产,推动企业从产业链的低端向高端转化。对于产业链中的薄弱环节进行重点培育,对产业链中的关键环节进行强化提升,形成竞争优势不断加强的发展格局,提高生物医药产业的发展质量和水平。聚焦人工智能及大数据等数字技术与生物医药产业的结合,重点引进人才及技术,在新技术的赋能下,带动生物医药产业的创新发展。 3.4 鼓励企业开展多元化、创新性的发展模式探索 鼓励企业探索与科研院所、创新型企业、研发人才的合作,拓展自主研发、合作研发能力,构建多种模式的研发生态体系。鼓励企业和跨国药企开展合作,吸收跨国药企在全球运营中的经验。在我国医药产品控费的大环境下,企业要整合研发、生产、流通环节实现成本的最优,通过低成本及创新策略来发展。企业要加强其所选细分赛道与其自身核心竞争力的契合,积极参与行业整合,实现共赢。 3.5 企业努力打造医药健康大品牌 推动天津市生物医药产业的创新发展,就要把打造医药企业自己的品牌建设放在重要位置。企业应在注重新产品开发的同时努力打造自己的品牌,政府积极推动生产要素向优势企业流动,引导企业增强品牌意识,提升内在素质,争创知名品牌。开展品牌形象宣传活动,积极参加国际知名的医药产业展会,提高品牌的知名度及美誉度。龙头企业要整合全球优质资源,以创新为驱动,实现品牌国际化,打造知名的世界品牌形象。 3.6 构建更广泛的生物医药产业联盟 构建更广泛的生物医药产业联盟,促进人才及技术的快速流动;鼓励高校、科研院所等技术研发单位与产业集群加强战略合作,形成产学研相结合的集群创新体系。通过跨区域产业联盟,企业、科研机构联合开展重大课题、重要技术的研究开发,推动产业技术的快速发展;推动医药技术载体平台的共建共享,实现跨区域产业链分工合作。 3.7 不断完善生物医药产业的发展政策 继续做好政策环境的优化,通过对企业、人才的优惠政策加大扶持力度,提高服务水平,简化政策兑现流程,营造宽松、开放的发展环境。要继续完善针对生物医药产业创新的从早期研发、临床开发、产业化、承接转化、产业促进到市场推广等各方面的政策,重点研究药品上市许可持有人、医疗器械持有人制度,从顶层设计为天津市生物医药产业的创新发展指引方向。
  • [资讯] 万古糖胺对万古霉素刺激小鼠巨噬细胞RAW 264.7 吞噬功能的影响
    摘要:败血症是非心脏重症监护室中导致患者死亡的常见原因,其特征是微生物病原体过度刺激免疫细胞引起全身性炎症反应。传统的抗生素治疗仍然是临床上败血症的有效疗法之一。以万古霉素( vancomycin) 为代表的糖肽类抗生素,是治疗由革兰阳性菌如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( methicillin-resistant S. aureus,MRSA) 引起的严重败血症的首选药物。但随着临床上相继出现了耐万古霉素肠球菌( vancomycin resistant Enterococcus,VRE) 、万古霉素中度耐药性金黄色葡萄球菌( vancomycinintermediate S. aureus,VISA) 、耐万古霉素金黄色葡萄球菌( vancomycin resistant S. aureus,VRSA)等万古霉素的耐药菌,半合成糖肽类抗生素的研发迫在眉睫。LYWW01 是通过对万古霉素产生菌Amycolatopsis orientalis HCCB10007 中的糖基转移酶基因进行异源置换操作,在万古霉素6-氨基酸残基上导入L-万古糖胺得到的一种新型糖肽类化合物。前期体外抗菌实验发现LYWW01 抗菌谱与万古霉素类似。但体内实验中,LYWW01 静脉给药对金黄色葡萄球菌MSSA 08-2 感染的小鼠具有体内保护作用,半数有效量( median effective dose,ED50) 显著低于万古霉素。 近年的研究发现,万古霉素除了主要用于对抗病原菌外,体外研究模型表明其还能增强巨噬细胞的吞噬功能。巨噬细胞是分布于各组织器官中的重要免疫细胞,不仅可识别、吞噬和清除入侵的病原菌,而且能通过调控各种细胞因子和趋化因子的转录表达调节免疫微环境。LYWW01 与万古霉素相比仅在6-氨基酸残基上多一个L-万古糖胺基团,但对小鼠的体内保护作用优于万古霉素,推测其也能调节机体的免疫功能。本研究以小鼠巨噬细胞RAW 264. 7 为受试免疫细胞,通过比较万古霉素和LYWW01 对巨噬细胞功能活性的影响,包括从对巨噬细胞吞噬MRSA 的影响,细胞因子肿瘤坏死因子-α( tumor necrosis factor-α,TNF-α) 和白细胞介素6( interleukin-6, IL-6) 的表达以及ROS 的产生等几个方面进行综合评判,初步探索万古糖胺影响万古霉素调节先天免疫反应的机制。 材料与方法 1 药品与试剂 化合物LYWW01( 上海来益生物药物研究开发中心,批号: 20090606,含量> 95%) ; 万古霉素标准品( Sigma 公司,批号: V2002-1G,规格: 1 g,含量>96. 5%) ; 庆大霉素( Sigma-Aldrich 公司,批号: E003632-10G,规格: 10 g) ; MHB( Mueller-Hinton Broth) 培养基( 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司,批号:HB6231-1,规格: 250 g) ; LB( Luria-Bertani) 营养琼脂培养基( 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司,批号: HB0129,规格: 250 g) ; 10 × 磷酸缓冲盐溶液( phosphate buffer saline,上海双螺旋生物科技有限公司) ; DMEM( Dulbecco's modified Eagle medium,high glucose,Gibco 公司) ; FBS ( fetal bovine serum,Sigma-Aldrich 公司) ; Triton-X 100( 上海源叶生物科技有限公司) ; LTA ( lipoteichoic acid,Biosharp 公司) ; 活性氧试剂盒( 上海碧云天生物技术有限公司) ; mRNA 提取试剂盒( Takara 公司) ; 反转录荧光定量试剂盒( BBI 公司) 。 2 仪器 细胞培养板( Thermo 公司) ; FrontierTM 5000Multi Pro 多功能离心机( Ohaus 公司) 。 3 实验菌株 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC 43300。 4 细胞培养 小鼠单核巨噬细胞株RAW 264. 7 ( ATCC®TIB-71TM) - 80 ℃冻存,使用前用37 ℃温水解冻,用含10% FBS 的DMEM 培养液于37 ℃,5% CO2培养箱中常规培养。培养3 d 后换液继续培养至对数生长期,将对数生长期的RAW 264. 7 细胞以5 × 105CFU·mL-1接种在12 孔板中,贴壁6 ~ 8 h。 5 菌悬液的制备 从- 80 ℃冰箱取ATCC 43300( MRSA) 菌株甘油保藏管,在LB 琼脂平板进行平板划线,于37 ℃培养箱过夜培养,挑取单菌落接种于5 mL MHB 肉汤培养基,置于转速220 r·min-1 ( 37 ℃) 摇床中培养12 h,8 000 r·min-1离心4 min,去上清,PBS 洗涤菌体3 次后,在DMEM + 10% FBS 中稀释至约1 × 107CFU·mL-1 ( 或感染复数MOI = 10)。 6 巨噬细胞吞噬功能的测定 按照“4”项下的方法处理细胞,用PBS 洗涤单层细胞3 次,分别给予细胞不同浓度LYWW01( 2,20 和200 μmol·L-1 ) 和万古霉素预处理。1 h 后洗去药物,加入制备好的菌悬液,1 000 r·min-1离心5 min,使MRSA 菌株充分接触巨噬细胞。在37 ℃,5% CO2培养箱中吞噬1 h 后,用PBS 洗涤单层细胞3 次,加入新鲜DMEM + 10% FBS 及庆大霉素( 100μg·mL-1 ) 。37 ℃,5% CO2培养箱孵育2 h 后,用PBS 洗涤单层细胞3 次。加入1% Triton-X 裂解10 ~ 20 min,稀释涂布平板计数。 7 细胞因子的mRNA 表达检测 按照“4”项下的方法准备细胞,分别给予细胞一定浓度的LYWW01 和万古霉素预处理30 min,LTA( 10 μg·mL -1 ) 刺激6 h 后,弃细胞上清,每孔500 μL TRIzol 收样,提取总mRNA,反转录为cDNA,通过荧光定量PCR 检测细胞因子TNF-α 和IL-6 的mRNA 表达水平。 8 胞内ROS 检测 按照“4”项下的方法处理细胞,用PBS 洗涤单层细胞3 次,分别给予一定浓度的LYWW01 和万古霉素与细胞共孵育,24 h 后洗去药物。LTA( 10 μg·mL-1 ) 刺激6 h 后,弃细胞上清,加入DCFH-DA 试剂( 终浓度10 μmol·L-1 ) ,37 ℃ 避光反应30 min。于488 nm 激发波长、525 nm 发射波长下检测各孔荧光强度。 9 统计分析 通过Excel 和SPSS 13. 0 处理实验数据,结果以`x ± s 表示,两组间比较采用t 检验法,多组间比较采用方差分析,P < 0. 05 时存在显著性差异,P < 0. 01时存在极显著性差异。 结果 1 万古霉素及LY WW01 对巨噬细胞吞噬活性的影响 有研究报道万古霉素能增强巨噬细胞的吞噬活性。本研究以20 μmol·L-1万古霉素和LYWW01分别刺激RAW 264. 7,巨噬细胞吞噬MRSA 的结果见图1。 相比未加任何药物处理的对照组,巨噬细胞经过万古霉素或LYWW01 预处理后,吞噬细菌数相对于对照组均明显升高。且LYWW01 对吞噬活性的刺激作用极显著,强于万古霉素( P < 0. 01) 。 2 不同浓度万古霉素及LYWW01 对巨噬细胞吞噬活性的影响 为进一步探究不同浓度下万古霉素及LYWW01刺激巨噬细胞的吞噬活性,测定了2,20 和200 μmol·L-1浓度下,万古霉素和LYWW01 对RAW 264. 7 吞噬MRSA 的结果( 见表1) 。结果显示LYWW01 对巨噬细胞的吞噬能力呈浓度依赖性的降低作用,在2 μmol·L-1下,吞噬功能极显著强于万古霉素处理组( P < 0. 01) ,对MRSA 的吞噬率高于同等浓度万古霉素组48%,表明万古糖胺能增强万古霉素刺激巨噬细胞的吞噬活性。 3 万古霉素及LYWW01 对巨噬细胞相关细胞因子的影响 细胞因子如TNF-α 和IL-6 等在炎症反应应答中起关键作用,进一步选取2 μmol·L-1LYWW01探究细胞因子( TNF-α 和IL-6) 表达对吞噬活性的影响。结果显示LYWW01 诱导了更多TNF-α 的释放,且相比万古霉素处理组具有显著性差异( P < 0. 05) ,而IL-6 的表达上LYWW01 和万古霉素处理无显著性差异( P > 0. 05) 。表明万古糖胺能促进万古霉素刺激细胞因子TNF-α 的表达( 见图2) 。 4 万古霉素及LYWW01 对巨噬细胞胞内ROS 的影响 ROS 作为机体重要的氧化还原信号分子,参与调控促炎细胞因子的表达。为进一步考察万古糖胺对万古霉素刺激巨噬细胞因子TNF-α 的释放是否与胞内ROS 的产生有关,测定了2 μmol·L-1LYWW01 处理RAW 264. 7 后胞内ROS 的含量( 见图3) 。结果显示LYWW01 处理组的胞内ROS 高于万古霉素处理组,在统计学上具有显著性差异( P <0. 05) 。 结合以上实验结果,推测万古糖胺可能通过提高胞内ROS,促进细胞因子TNF-α 的表达,进而增强万古霉素对巨噬细胞的吞噬活性。 讨论 细胞因子如TNF-α 和IL-6 在炎症反应应答中具有关键作用,TNF-α 的表达能促进巨噬细胞的吞噬功能。ROS 作为氧化还原信号传递的重要分子,间接调节各种细胞因子的表达。有研究发现ROS 抑制剂夹竹桃麻素能显著降低巨噬细胞中TNF-α 和IL-6 的表达,此项研究结果与我们的发现一致,表明在先天免疫反应中存在着ROS 依赖性的细胞信号传导。 有研究报道糖基化不仅影响蛋白质的天然构象,还能调控巨噬细胞因子的表达。本研究表明,在万古霉素6-氨基酸残基上增加一个L-万古糖胺基团后,巨噬细胞的吞噬活性相比单独万古霉素组显著提高。进一步研究发现万古糖胺对万古霉素刺激巨噬细胞吞噬活性的增强可能与ROS 的释放有关。ROS 作为重要的氧化还原分子,间接参与调控细胞因子( TNF-α 和IL-6) 的表达,进而增强巨噬细胞的吞噬活性。因此糖基化结构修饰可能通过改变氧化还原信号通路,影响机体的免疫功能。
  • [资讯] FDA 批准大麻二酚用于治疗难治性癫痫的审评思路分析
    摘要:Epidiolex 口服溶液为美国FDA 于2018 年6 月25 日批准的新药制剂,每1 mL 溶液含有100 mg大麻二酚( CBD) 。其活性成分CBD 是FDA 首次批准的来源于大麻的高纯度原料,用于治疗2 种罕见的、严重性癫痫Dravet 综合征( Dravet syndrome,DS)和Lennox-Gastaut 综合征( LGS) 。 CBD 用于治疗DS 和LGS 获FDA 优先审评和孤儿药地位,用于治疗DS 获快速通道认定。在Epidiolex 口服溶液审评时,FDA 考虑了以下方面。 1 大麻产品的植物来源和人用经验 1. 1 药材及其成分 大麻来源于大麻( Cannabissativa L.) 、印度大麻( Cannabis indica Lam) 和莠草大麻( Cannabis ruderalis Janisch. ) ,主产于中亚和印度,一直以来大麻植物被用作纤维、食品等,也被用于医学、消遣及宗教。 目前从大麻中分离的成分有大麻素、单萜、倍半萜、黄酮、类固醇以及含氮化合物。其中,鉴定了750 种天然成分,大麻素104 种,三萜类化合物200 种以上,另外还有cannabimimetic 等成分。这些化合物中被广为人知的是δ-9-四氢大麻酚( Δ9-THC) ,它也是大麻中精神活性最强的成分,其他常见的大麻素类成分还包括CBD 和大麻酚( CBN) ,以上3 种成分约占大麻素的90%。非药用植物的THC 含量相对较低,CBD 含量较高,而药用植物正好相反。3 种主要大麻素类成分的结构见图1。 根据文献记载,大麻中的CBD 被用于治疗癫痫及多发硬化症,大麻植物提取物( 含THC和CBD) 用于耐药的精神分裂症患者。 1. 2 大麻植物及其成分在各国的管制情况 关于大麻的管制问题,要追溯到1961 年联合国毒品和犯罪问题办公室发布的一系列关于麻醉药品的管制公约,包括1961 年的《麻醉品单一公约》( 《Single Conventionon Narcotics drugs of 1961》) 、1971 的修订版、1988 年《联合国禁止非法贩运麻醉药品和精神药物公约》,这些公约旨在要求成员国建立或指派专门的公共机构对非工业大麻进行管理。由此,各国出台相应配套法律、法规,对麻醉品和精神药物的种植、使用、加工等进行管制。 近些年,各个国家对医用大麻的管制逐渐放开。美国缉毒局( Drug Enforcement Administration,DEA)管制药品法( Controlled Substances Act,CSA) ,将大麻及其提取物列为“一级管制物质”,即滥用可能性最高。但从1996 年开始个别州允许医用大麻的使用,至2019 年已有33 个州允许医用大麻使用。2001 年6 月30 日加拿大最高法院将医用大麻合法化。2001 年英国内政部颁布的《药品滥用条例》及《药品滥用法令》将大麻原料按1 级( Schedule 1)管制药品的B 类( class B) 管理。德国于2017 年3月10 日颁布了《大麻药用法》,并成立大麻管理局,进一步扩展大麻处方药的使用。我国尚未放开医用大麻的种植和使用,仅允许工业用大麻纤维和种子的种植和使用。 相对于大麻植物在各个国家的严格管制,对于含有大麻素类成分的药品,管制相对宽松。Marinol( dronabinol,合成屈大麻酚) 最初被DEA 定为Ⅱ级管制品,后随着对该药品滥用可能性的全面评估,认为滥用可能性较低,故将其降为Ⅲ级。2013 年3月,英国对来源于大麻的药品Sativex 进行了分类变更,将其列入4 级( Schedule 4) 的第1 部分( part 1) ,对持有、供应用于研究或其他特别用途的Sativex 不再需要英国内政部的许可。 各个国家除对医用大麻放开外,有些国家对于消遣大麻的使用也进一步放开,2018 年10 月,加拿大将消遣大麻的使用合法化。到2019 年美国已有10 个州允许使用消遣大麻。 1. 3 全球含大麻成分药品的批准情况 一些大麻素成分已经批准用于治疗疾病。Marinol( 商品名)胶囊是由合成THC 与芝麻油制成,作为新分子实体( NME) 在美国获得批准,用于常规药品治疗疗效不明显的癌症化疗患者的恶心和呕吐( 1986 年批准) ,以及治疗艾滋病患者的厌食和体重减轻( 1992 年批准) ,随后在加拿大、丹麦等国上市。Sativex( 商品名) 是由CBD 和THC 与无水乙醇、丙二醇和薄荷素油组成的口服舌下雾化喷剂,于2010 年获得英国批准,随后在瑞士、加拿大、澳大利亚、新西兰等国上市,用于多发性硬化症成人患者神经性疼痛症状缓解的辅助治疗。 2 疾病与临床 2. 1 DS 和LGS 疾病特点 DS 是一种罕见的遗传性疾病,患者通常1 岁以内就开始发病,初始症状为经常性热性惊厥,随后会出现其他典型的癫痫发作,包括肌阵挛发作,也可能出现危及生命的癫痫持续状态,需采取急救措施。典型DS 患儿会出现语言和运动能力发育不良、多动症和人际交往困难等。 LGS 的特点是可出现多种类型的癫痫发作,通常在3 ~ 5 岁开始反复出现癫痫发作。超过3 /4 的患者会发生强直性发作,导致肌肉不受控制收缩。几乎所有的患儿会发生智力障碍、运动能力( 如坐和爬等) 发育迟缓。一些患者甚至连日常生活都不能完全自理,生活质量受到严重影响。 DS 和LGS 都是罕见、严重、难治的癫痫综合征,在儿童早期开始发病。这2 类综合征被归为进展性和癫痫性脑病,癫痫发作所导致的发育迟缓和行为异常超出基础疾病的病理学,其特征是多种类型癫痫发作,且对许多癫痫常规治疗药物无效。癫痫持续状态和突然意外死亡( SUDEP) 导致这2 类癫痫综合征的死亡率高于一般癫痫患者。 2. 2 DS 和LGS 的治疗现状 除了常规的癫痫治疗药物外,目前没有批准专门用于DS 的药物。FDA批准了6 个专门用于LGS 的药物,包括氯巴占( clobazam) 、卢非酰胺( rufinamide) 、托吡酯( topiramate)、拉莫三嗪( lamotrigine) 、非尔氨脂( felbamate)和氯硝西泮( clonazepam) 。与已批准的药物相比,CBD 是一个新的分子实体,在结构上与其他已批准癫痫治疗药物不同。 2. 3 FDA 批准本品临床方面的考虑 基于DS 和LGS 均具有罕见、严重、难治的特点,目前尚无有效的治疗手段,癫痫发作难以控制,对患者的生活质量产生巨大影响,FDA 批准了Epidiolex。该药品除了为LGS 患者提供了更多的治疗选择外,它也是首个批准专门用于DS 的药物,为DS 患者提供了更为有效的治疗手段。Epidiolex 的批准说明,通过开展良好的试验研究合理地评价大麻中活性成分,可以提供重要的医学治疗方法。通过对照临床试验检验药品的安全性和有效性,并按照药品批准程序进行严格审评,是将大麻衍生产品用于患者治疗的最合理的方式。鉴于Epidiolex 批准经过良好的、充分的临床试验验证,能够确保药品规格一致性和给药剂量的准确性,从而使处方医生有信心将其用于治疗复杂的、严重性癫痫症状。 3 CMC 研究 受到美国《信息自由法》( FOIA) 的限制,FDA 对有关生产和质量的资料公开非常有限。 3. 1 大麻药材的控制 CBD 来源于天然大麻( Cannabis sativa L. ) ,为白色至淡黄色结晶固体,不溶于水,可溶于有机溶剂,化学名为2-[( 1R,6R) -3-methyl-6-( 1-methylethenyl ) -2-cyclohexen-1-yl ]-5-pentyl-1,3-benzenediol ( IUPAC /CAS) ,其化学式为C21H30O2,分子量314. 46,结构式见图1。 申请人最初将大麻药材作为起始原料,但是经过深入审评后,FDA 认为Epidiolex 为从植物中提取的高纯度成分,不属于植物药,故未将大麻药材作为CBD 的起始原料,即便未将其确定为起始原料,申请人仍然按照WHO 的GACP 及种植方案对植物原料( BRM) 的种植、采收及初加工进行控制。申请人提供了目前种植温室的地理位置、生长情况、批与批之间的一致性,同时双方就重金属、农残和黄曲霉素等有害残留物的检验进行沟通。 3. 2 微生物限度 Epidiolex 为非无菌口服制剂,无防腐剂。检验的129 批次产品微生物限度均符合质量标准规定。根据USP51 进行的抗菌效力检查试验表明,d 14 和d 28 微生物降低超过4 个数量级,说明制剂本身可能具有抗微生物活性。此外10 批API 微生物限度结果也表明微生物无增殖。通过对制剂生产过程的风险评估,表明微生物污染的风险很低。根据监管部门的要求,申请人将微生物限度纳入制剂质量标准中,每10 批检验1 次。 3. 3 稳定性 制剂在长期贮存条件下放置( 25 ℃ /60%RH) 24 个月,结果表明产品在24 个月内稳定,审评认为从产品质量、微生物的角度,支持制剂有效期的稳定性结果和数据是充分的。因此,确定Epidiolex有效期为24 个月,贮存条件为20 ~ 25 ℃; 保存条件允许偏差在15 ~ 30 ℃。在第1 次打开瓶子后12 周内用完,否则丢弃。 3. 4 批准前现场检查 FDA 采用基于风险的现场检查计划,将现场检查分为优先检查和其他情况。其中优先检查列出了9 种高风险情况,但即便列入优先检查标准的产品,也可以免于检查直接作出结论,并非所有申请注册和补充申请的情况均开展批准前检查。这提示FDA 对批准前现场检查的实施是有选择和重点的。批准前检查的目的主要有3 个方面: ① 检查该企业是否具有商业化大规模生产的能力。② 检查实际情况与注册申报资料是否一致。③ 检查数据的真实性。 本品进行了批准前现场检查,未发现可能导致申请不被批准的生产或设施等突出风险,在设施方面是符合相关要求的。 3. 5 原辅包关联审评 在FDA 递交资料中,对于制剂所用到的物料包括原料、辅料、包材等可以采用供应商直接递交资料的方式进行,即药物主文件( DMF) 制度。该制度最大的优点在于既充分保护了原辅料生产商的知识产权和保密信息,又使审评当局和制剂生产商获得了满足药品制剂上市需要的所有资料,极大节省了药品上市审评的时间,提高了审评效率。Epidiolex 的审评中列出了涉及的DMF文件,其中包括1 项Ⅱ类DMF 和3 项Ⅲ类DMF。我国也已经开始实施原辅包关联审评备案制度。 4 非临床研究 4. 1 作用机制 癫痫的发病机制较为复杂,目前临床认为是由于中枢神经系统的兴奋性和一致性失衡所导致,其与离子通道、神经递质失衡、神经胶质细胞、遗传和免疫密切相关。抗癫痫药物的作用机制包括: 作用于离子通道( 钠、钙、钾、氯离子) 、神经递质( 谷氨酸、γ-氨基丁酸、神经肽) 、神经胶质细胞、自身抗体、P-糖蛋白等。 CBD 在结构上与其他抗癫痫药物( AEDs) 不同,其作用机制尚不明确,据推测它可能通过调节腺苷及细胞内钙离子等多种因素降低某些神经元的兴奋性。 4. 2 大麻成瘾性及其与CBD 的关系 根据文献记载,大麻产生依赖性的主要成分是THC,而CBD没有致幻作用。即大麻之所以被定义成“毒品”,其影响精神活动的成分是THC。 动物滥用实验表明,CBD 不会产生类似大麻素的行为反应。在药物辨别试验及自身给药试验均表明它不会产生奖赏效应。 一项人体滥用潜在研究也显示,在禁食状态下,向非依赖性成人消遣吸毒者急性给予治疗剂量和超治疗剂量的CBD 产生的主观积极评分( 例如药物喜欢和再次服用药物) 在安慰剂的可接受范围内,且明显小于屈大麻酚( 合成THC,Ⅲ级管制药品) 以及阿普唑仑( IV 级管制药品) 产生的主观积极评分。 在使用CBD 进行的其他Ⅰ期临床研究中,未发生滥用相关的不良事件报告。在人体依赖性研究中,给予成人CBD 共28 d,在停药后的6 周内没有产生戒断症状或体征,这表明CBD 不会产生身体依赖。故在2018 年9 月28 日,DEA 将已批准的Epidiolex定为V 级管制品,该级别的药物被滥用的可能性最低。 4. 3 剂量探索 CBD 的服用剂量是基于先前人用经验、文献报道、动物实验等确定。其中,成人4 周CBD 耐受剂量为21. 4 mg·kg-1·d-1 ( 按人体重70 kg计,相当于1 500 mg·d-1 CBD) ,儿童患者的耐受剂量为22 mg·kg-1·d-1 申请人推荐对DS 和LGS 患者采用同样的给药方案。10 mg·kg-1·d-1作为维持剂量,必要时可以滴定至20 mg·kg-1·d-1。临床试验显示20 mg·kg-1·d-1比10 mg·kg-1·d-1不良反应更高,尤其在转氨酶升高方面。故在有效性支持的情况下,推荐采用低剂量( 10 mg·kg-1·d-1 ) 进行维持治疗。对于某些特殊情况下( 例如患者发生特殊的高痉挛负担) ,处方医生可能希望剂量更快达到20 mg·kg-1·d-1,FDA认为将DS 患者的目标维持剂量范围定在10 ~ 20mg·kg-1·d-1是合理的。 在临床试验过程中,初始给药剂量为2. 5 mg·kg-1·d-1,随后逐渐增加至10 mg·kg-1·d-1。为了方便使用和改善耐受性,申请人将标签中的起始剂量调整为5 mg·kg-1·d-1,逐渐增加剂量至最大值20 mg·kg-1·d-1。该剂量已在EAP 的给药方案中使用,且耐受性良好。 与所有抗癫痫药物一样,停用Epidiolex 时,剂量应逐渐减少。 4. 4 药动学 在稳态( Css) 下,CBD 的最大血浆浓度时间( Tmax) 为2. 5 ~ 5 h。与健康志愿者的禁食状态相比,Epidiolex 与高脂肪/高热量餐的共同给药使Cmax增加5 倍,AUC 增加4 倍,并且总变化性降低。 CBD 在健康志愿者的表观分布体积为20 963 ~42 849 L。CBD 及其代谢物的蛋白质体外结合率>94%。 在CYP2C19 和CYP3A4 酶以及UGT1A7,UGT1A9和UGT2B7 同工酶作用下,CBD 在肝脏和肠道( 主要在肝脏中) 代谢。当CBD 重复给药时,其活性代谢产物7-羟基-CBD 的AUC 比母体药物低38%。当7-羟基-CBD 代谢物转化为7-羧基-CBD 时,其AUC 比母体药物高约40 倍。基于癫痫发作的非临床模型,代谢物7-羟基-CBD 具有抗癫痫活性,代谢物7-羧基-CBD 没有抗癫痫活性。Epidiolex 在粪便中排泄,肾脏清除率较低。 4. 5 毒性 体外( Ames) 和体内遗传毒性试验( 大鼠彗星试验和骨髓微核试验) 结果显示CBD 呈阴性。Epidiolex 中有4 种杂质限度高于ICH 规定的定性限度,且这些杂质拟定的限度超出了非临床批次样品的实际含量。因此,对这些杂质进行了体外、体内遗传毒性试验、13 周或26 周大鼠口服( 灌胃) 重复给药毒性试验及生殖毒性的大鼠胚胎发育试验等。FDA 认为杂质研究是充分的,确定的限度也相对合理。 5 临床研究 5. 1 有效性 Epidiolex 有效性通过3 项随机、双盲、安慰剂对照临床试验验证,试验共纳入516 例DS 和LGS 患者。 其中2 项研究在396 例2 ~ 55 岁LGS 患者中进行,分别将Epidiolex 10 和20 mg·kg-1·d-1与安慰剂进行比较,结果与安慰剂相比,Epidiolex 与总癫痫发作频率( 下降和非癫痫发作) 显著降低相关,受试者/监护人整体印象变化量表( S /CGIC) 有了更大的改善。另外一项在120 例2 ~ 18 岁DS 患者中进行,将Epidiolex 20 mg·kg-1·d-1的剂量与安慰剂比较,结果发现治疗组惊厥发作频率中位数较基线相比,变化百分比( 减少) 显著大于安慰剂组。在Epidiolex开始治疗的4 周内观察到惊厥性癫痫发作的减少,并且在14 周治疗期间效果基本保持一致。 5. 2 安全性 在临床试验中Epidiolex 常见的不良反应( 发病率至少10%且高于安慰剂) 有嗜睡、肝酶水平升高、食欲减退、腹泻、皮疹、疲倦、虚弱和不适、失眠、睡眠质量下降、感染等。跟其他所有治疗癫痫的药物一样,Epidiolex 也存在某些严重风险,如抑郁、自杀倾向、狂躁、攻击行为等。还可能引起肝脏损伤,通常比较轻微,但也可能出现一些比较罕见但十分严重的肝损伤,并引发恶心、呕吐、腹痛、疲倦、厌食、黄疸、尿色变深等。DS 和LGS 儿童和成人患者中的不良反应相似。 5. 3 上市后要求( PMR)  PMR 是药品批准时或批准后,基于评估安全风险信号、已知严重风险或识别未知安全风险的目的,FDA 强制要求企业开展的上市后研究或临床研究。基于此,FDA 要求Epidiolex 继续进行17 项上市后研究,包括: 8 项药物相互作用研究( 如与肝脏药物代谢酶和咖啡等的相互作用) ,1 项对妊娠妇女的影响研究,1 项慢性肝损伤研究,1项肾脏影响研究,1项致癌性研究,1项最大耐受剂量下的QT 研究; 4 项针对主要代谢产物7-羧基-CBD 的研究,包括胚胎发育、动物毒理学研究以及致癌性研究。 6 讨论 FDA 对植物来源药品的分类明确,确保药用植物得到一定程度的控制。CBD 为来源于植物的高纯度化合物,根据《植物药工业指南》,经高度纯化的植物成分不属于植物药,与其他一些来源于植物的高纯度药品( 紫杉醇、喜树碱、地高辛等) 一致,而与FDA 已批准的2 个植物药( Veregen,Crofelemer)有所不同。我国的中药分类中,一类中药是“未在国内上市销售的从植物、动物、矿物等物质中提取的有效成份及其制剂”,我国此类药物有时也按照化学药新药申报。 FDA 优先、加快审评制度,确保药品尽早上市,保证用药可及性。FDA 的审评制度中除了优先审批、快速审批、孤儿药身份认定,还包括突破性治疗、加速审评等。在IND 和NDA 审评、审批的各个阶段都采取措施( 沟通、交流会议,持续滚动递交资料) 保证药品的快速审评审批。在Epidiolex 的审评过程中,FDA 授予该申请优先审批,DS 快速审批,孤儿药DS 和LGS 适应证。我国在这方面也已经制定了一系列相应的政策。 审评报告保密制度保证了药品企业的商业机密不被泄露。根据公开、透明的要求,我国的审评意见也将被公开,美国的保密制度相关规则值得我们借鉴。 根据严格的临床设计,基于风险获益评价批准新药上市。Epidiolex 来源于大麻植物,为Ⅰ级管制物质,但经加工得到的高纯度CBD 无依赖性,定为V 级管制药品,最终认为获益大于风险而批准用于治疗难治性DS 和LGS。 上市后研究,《食品药品管理修正法案》赋予FDA 明确的权利,通过法律规定促使申请人完成( Postmarketing Requirement,PMR) ,进一步收集药品的安全性、有效性信息,具有一定的强制性。申请人也可进行上市后研究承诺( postmarketing commitment,PMC) ,其为申请人同意进行的相关研究,与法规要求关联性小。在批准Epidiolex 的同时,FDA 也提出了17 项推荐的PMR。 天然药物成分药品同时关注非活性成分存在的过敏。Epidiolex 说明书中声称“不含任何由谷蛋白的谷物制成的成分( 小麦、大麦或黑麦) ”。这体现了FDA 对天然药物成分制剂中非活性成分可能导致的过敏的关注。 对于植物来源的高纯度原料,FDA 仍对药材进行了一定程度的关注和要求。包括植物基原、地理位置、生长情况、采收、初加工、药用植物种植和采集质量管理规范( Good Agricultural and Collection Practice,GACP) 符合性、植物原料批间一致性、重金属、农残、黄曲霉毒素等。
  • [资讯] 夏枯草水提物对过敏性结膜炎大鼠NLRP3 /Caspase1 / IL-1β通路的影响
    摘要:过敏性结膜炎( allergic conjunctivitis,AC) ,又称变态反应性结膜炎,是眼科常见的非感染性眼表疾病,主要好发于儿童和青少年。本病易反复发作,常呈现季节性加重或常年持续存在,多可与其他过敏性疾病伴发,患病人群可高达20%。近年来随着全身各种其他变态反应疾病如过敏性鼻炎、哮喘等发病率升高,环境污染的加重,过敏原的增多,AC 发病率逐年增高。主要症状有眼痒、眼红、结膜充血水肿,可致视力减退和角膜损伤,严重影响正常学习生活。该病属于中医领域的“目痒症”等范畴,中医认为该病的发生与肝血不足、肺气不固有着极为密切的联系。角膜与结膜邻近,结膜炎也极有可能殃及角膜浅表层。 夏枯草是唇形科夏枯草属植物夏枯草( Prunellavulgaris L. ) 的干燥成熟果穗,其主要化学成分包括三萜类、甾体类、香豆素类、黄酮类、苯丙素类等,有着广泛的药理活性,具有降血压、降血糖、抗炎免疫、抗病毒等作用,因其重要的药用价值而得到了众多学者的关注和研究。其味辛、苦、性寒,归肝、胆经,具有清肝泻火、散结消肿、明目的功效。临床上主要用于治疗急性黄疸性肝炎、目赤肿痛、单纯疱疹病毒性角膜炎和高血压等症。已有文献报道其能够在抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、调节免疫等方面起重要作用。“肝开窍于目,目受血而视”,即肝气血失调则易发目病,肝火上攻于目,则目赤肿痛。夏枯草入肝经,清肝火,善治目赤肿痛。但其对过敏性结膜炎模型大鼠的作用未见报道。 因 此,本研究利用鸡卵清蛋白( ovalbumin,OVA) 诱导的AC 大鼠模型,研究夏枯草对AC 模型大鼠角结膜的抗炎作用,探讨夏枯草对AC 模型大鼠角结膜的作用及其机制。 材料与方法 1 药品与试剂 夏枯草( 湖南中医药大学第一附属医院中药房,基源地为安徽夏枯草GAP 基地,经湖南中医药大学药学院中药鉴定教研室刘塔斯教授和龚力民副教授共同鉴定为唇形科夏枯草属植物夏枯草Prunellavulgaris L. 的干燥果穗) ; OVA( A5503,Sigma 公司) ; O. C. T 冰冻切片包埋剂( 4583,美国樱花公司) ; 苏木素( Bl702A) 、伊红( Bl703A) 、多聚甲醛( BL539A,Biosharp 公司) ; 氢氧化铝( A7130) 、PBS粉剂( 66-1501) ; 封闭山羊血清( SL038,Solarbio 公司) ; DAB kit ( ZLI-9018,中杉金桥公司) ; 白蛋白Albumin ( C511BA0022,BBI Life Sciences 公司) ;SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒( cw0022s,康为世纪) ;BCA 蛋白定量试剂盒( 70-PQ0012,联科生物) ; 抗IL-1β 抗体( A11370) 、抗NLRP3 抗体( A5652) 、抗Caspase-1 抗体( A0964,ABclonal 公司) ,二抗betaactin( Proteintech 公司) ; GAPDH ( Cusabio 公司) ;Tublin( Sigma 公司) ; 0. 2 μm PVDF 膜、ECL 显影试剂盒[WBLUR0500,密理博( Millipore) 公司]; 氯雷他定胶囊( 国药准字H20041044,湖北舒邦药业有限公司) ; 大鼠IL-1β ( 70-EK301B0 /2) ELISA 试剂盒( 联科生物) 。 2 仪器 1260 高效液相色谱仪( 安捷伦公司) ; OLYMPUS1*71 多功能显微镜( 奥林巴斯公司) ; Varioskan酶标仪( ThermoscienTific 公司) ; CM1900 冰冻切片机( 德国Leica 公司) ; Axioskop 2 正置显微镜+ 图像分析系统( 德国卡尔蔡司公司) ; centrif μge5415R 冷冻离心机( Eppendorf 公司) ; DW 86L388超低温冰箱( 海尔公司) ; AL104 电子分析天平( 梅特勒托利多仪器公司) ; SW CJ 2FD 超净工作台( 苏州净化公司) ; 全自动样品快速研磨仪、调速振荡器、电热恒温干燥箱、恒温水箱、单道移液器等( Eppendorf 公司) 。 3 实验动物 健康SPF 级实验SD 雄性大鼠,6 ~ 8 周龄,60只体重: 180 ~ 200 g,湖南斯莱克景达实验动物有限公司,许可证号: SYXK( 湘) 2016-0002,实验单位使用许可证编号: SYXK( 湘) 2013-0005。 4 药物制备 4. 1 夏枯草提取和质量控制 称取夏枯草经粉碎过80 目筛后的细粉1 200 g,用10 倍水2 次加热回流煎煮( 每次1 h) 后合并滤液并旋蒸浓缩,冷冻干燥得干浸膏474. 5 g,提取率为39. 5%,于- 20 ℃分装保存。 参照《中华人民共和国药典》2015 年版方法,对实验所用的夏枯草浸膏中迷迭香酸含量进行测定,迷迭香酸含量为3. 33%,符合药典标准( 迷迭香酸含量不得少于0. 2%) 。 4. 2 动物实验用药准备 夏枯草浸膏、氯雷他定胶囊均溶解在生理盐水中,阳性药物氯雷他定制成混悬液1. 05 mg·kg-1,夏枯草提取物低、中、高浓度分别为浸膏0. 497 7,0. 995 4 和1. 990 8 g·kg-1,相当于生药1. 26,2. 52 和5. 04 g·kg-1 5 动物模型制备及实验流程 将购买的SD 大鼠放入动物房适应1 周后开始实验,采用OVA 致敏的方法制作AC 大鼠模型。d 1 皮下注射含OVA 100 μg 和佐剂Al( OH)3 5 mg 的PBS 液200 μL,d 7 腹腔注射同样OVA PBS 液100 μg·0. 2 mL-1。d 8 ~ d 13 每天每只眼用OVA 400 μg 溶于5 μL 生理盐水中点眼; 分别于d 14 将OVA( 每眼750 μg) 溶于5 μL PBS 和d 16 将OVA( 每眼1. 5 mg) 溶于10 μL PBS 液中滴入双眼进行致敏原攻击。d 17 腹腔注射( ip) 1 次;分别在d 18 和d 20 将OVA( 每眼1. 5 mg) 溶于10 μL PBS 液中滴入双眼进行致敏原攻击。从d 17 ~ d 26 连续给药10 d; 于d 27 再次激发。观察20 min 后记录。 6 动物分组及处理 将60 只SPF 级实验SD 大鼠随机分为6 组,每组10 只。根据人-大鼠体表面积剂量计算灌胃( ig)给药: 正常组( Con) ,模型组( Mod) ,阳性药物组( Lor,氯雷他定混悬液1. 05 mg·kg -1) ,夏枯草提取物低( PVL) 、中( PVM) 、高( PVH) 剂量组( 浸膏0. 497 7,0. 995 4 和1. 990 8 g·kg-1,相当于生药1. 26,2. 52 和5. 04 g·kg-1) ,大鼠ig 给予体积为10mL·kg-1,连续给药10 d。 7 大鼠模型大体观察 结膜囊OVA 末次致敏后20 min,观察眼部体佂( 均观察右眼) 。观察是否出现结膜水肿、结膜充血、眼睑是否充血水肿、分泌物( 流泪) 等,以此判断大鼠AC 模型建立是否成功。 8 伊红( HE) 染色观察AC 模型大鼠组织病理变化 大鼠麻醉后,去除大鼠眼周围皮毛,用眼科剪环形取出右眼结膜; 开腹摘取大鼠肝组织( 取同一位置组织块) ,投入10%多聚甲醛固定液中固定,乙醇梯度脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋,粘片,脱蜡,染色,脱水,复染,脱水,透明,封片。待树胶干燥后,在光学显微镜下观察大鼠各组织病理改变。 9 免疫组织化学法检测 去除大鼠眼睛周围毛发,用眼科剪从巩膜的最大直径处剪开,环形剪下,去除眼内容物,保留角膜、结膜、部分巩膜,浸入10% 的多聚甲醛固定。梯度脱水后O. C. T 胶包埋,液氮速冻后行冰冻切片,切片厚度为10 μm。将低温保存的冰冻切片放至室温后,进行免疫组化实验,具体步骤如下: 60 ~ 65 ℃,烤片30 min; 滴加3% 过氧化氢,室温孵育10 min;PBS 洗涤5 min × 3; 之后滴加山羊血清于37 ℃封闭30 min; 滴加( 1∶ 200) 抗体稀释液稀释的一抗,4℃孵育过夜( 16 h) ; 37 ℃ 复温30 min,再用PBS 洗涤5 min × 3; 滴加抗体稀释液稀释( 1∶ 200) 后的二抗,37 ℃孵育30 min; 再用PBS 洗涤5 min × 3; DAB 显色3 min,蒸馏水洗涤,苏木素复染,盐酸酒精分化,晾干、封片,显微镜观察,采集图像。将采集到的图像,导入到图像分析系统Image J 中,在IHC-Toolbox插件对免疫组化阳性信号进行图像自动测量分析,采用组织学积分H-score 方法进行半定量分析,并完成统计分析。观察对比IL-1β,NLRP-3 和Caspase-1 蛋白的表达情况。 10 Western Blot 检测NLRP3,Caspase-1,IL-1β蛋白表达 将左眼结膜组织在液氮低温条件下粉碎,加入含PMSF 的RIPA 溶液( 1∶ 100) 冰上静置45 min,再在冰上超声20 min,12 000 r·min-1 ( 4 ℃) 离心30 min,取上清液。BCA 法蛋白定量后,取等量蛋白,加入上样缓冲液( loading buffer) 后煮沸10 min,备用。8%SDS-PAGE 电泳分离蛋白,采用三明治法湿法转膜。用5%脱脂牛奶在37 ℃恒温条件下封闭1 h。用抗体稀释液稀释抗体( 1∶ 1 000) ,4℃隔夜孵育。洗膜后用HPR 标记的二抗37 ℃孵育1 h。再次洗膜后TMB 显色液显影。 11 ELISA 检测IL-1β 因子含量 分离大鼠结膜后,立即腹主动脉取血,充分静置后,2000 r·min-1离心10 min 取上清即为血清。应用ELISA 法测定大鼠血清IL-1β 含量。12 统计学处理方法采用SPSS 20. 0 统计软件,计算资料结果以`x ± s 表示,两两比较采用LSD 检验,P < 0. 05 为差异有统计学意义。 结果 1 大鼠模型观察 如图1 所示,空白组大鼠运动活跃,不易激惹,结膜无明显充血、水肿,眼睑闭合睁开行为自如,眼周未见分泌物,不畏光。模型大鼠易激惹,躁动不安,眼睑有明显水肿呈半闭合态,结膜均可见明显充血呈深红色,且结膜水肿明显,眼周分泌物较正常大鼠多,有流泪和频繁的搔抓行为。说明模型建立成功。 2 夏枯草对过敏性结膜炎大鼠角膜的影响 2. 1 夏枯草对大鼠角膜病理变化的影响 如图2所示,角膜HE 染色结果显示,正常组及阳性药物组大鼠角膜上皮细胞层正常扁平,排列紧密整齐; 表层细胞未角化,组织结构清晰、透明,无充血肿胀,无炎症浸润,偶可见淋巴细胞吞噬。模型组大鼠角膜表面粗糙不平,上皮细胞层可见缺损及新生细胞,基质层纤维排列紊乱,可见大量嗜酸性粒细胞及新生血管。夏枯草各剂量组与模型组相比,嗜酸性粒细胞数量减少,上皮细胞排列紧密、未见缺损,基质层纤维排列较为整齐。 2. 2 夏枯草对大鼠角膜NLRP3,Caspase-1 和IL-1β 蛋白表达的影响 如图3 所示,结膜中NLRP3,Caspase-1 和IL-1β 免疫组化阳性表达呈现黄色或棕褐色。正常大鼠少见表达; 与空白组比较,模型组大鼠角膜中这3 种蛋白表达均增强( P < 0. 01) ; 与模型组相比较,各给药组表达蛋白明显下降( P <0. 01) ; 夏枯草各剂量组大鼠角膜NLRP3,Caspase-1和IL-1β 蛋白表达均降低( P < 0. 01) 。 3 夏枯草对大鼠角结膜NLRP3,Caspase-1 和IL-1β 蛋白表达的影响 如图4 所示,与空白对照组相比,模型组NLRP3,Caspase-1, IL-1β 的表达均增加,差异具有统计学意义( P < 0. 05,P < 0. 01,P < 0. 05) ; 与模型组相比,夏枯草低剂量组NLRP3 蛋白表达降低( P <0. 01) ,夏枯草中剂量组NLRP3,Caspase-1 和IL-1β蛋白表达降低( P < 0. 05,P < 0. 01,P < 0. 01) ,夏枯草高剂量组NLRP3 和Caspase-1 蛋白表达降低( P < 0. 05) 。 4 夏枯草对过敏性结膜炎大鼠血清IL-1β 的影响如图5 所示。 与空白对照组相比,模型组大鼠血清中IL-1β的表达提高( P < 0. 01) ,阳性药物组、夏枯草低、中、高剂量组大鼠血清中IL-1β 的表达较模型组均显著降低( P < 0. 01) 。 讨论 过敏性结膜炎是一种由变应原激发、IgE 介导的眼部炎症疾病,其主要病理表现为眼球结膜组织充血水肿、分泌物增多、引起眼部反复发作的瘙痒,严重者可影响到眼球的感光进而影响视力。主要由Ⅰ型和Ⅳ型超敏反应引起,已有研究表明炎症小体是各种自身变态免疫疾病的重要调节因子,在过敏性鼻炎、哮喘等模型动物的病理组织中有NLRP3,Caspase-1 炎症小体的表达。NLRP3 炎性小体是最具特征性的一类炎症小体,由NLRP3、蛋白酶Caspase-1 前体和ASC3 部分构成。静息状态时,NLRP3 是无活性的,在激活物作用下,损伤的线粒体激发活性氧( reactive oxygen species,ROS) 的产生,进而激活NLRP3。Caspase-1 前体被招募后进而激活形成有活性的Caspase-1,实现NLRP3 炎症小体的装配。随之激活核转录因子NF-κB,启动NLRP3,pro-IL-1β 和pro-IL-18 等的转录过程,上调炎症小体的表达,最终促进炎症因子IL-1β, IL-18 的成熟和分泌。有研究表明炎症小体在眼科常见疾病的发生发展中发挥着重要作用,角膜伴有更高水平的趋化因子和细胞因子如IL-1β 和IL-18,粒细胞水平也随之升高,提示NLRP3 炎症小体对角膜炎症具有调控作用。近年来过敏性结膜炎的治疗主要以药物治疗为主,但其疗程往往较长,且易复发,难以达到根治的目的。 夏枯草具有清肝明目之功效,虽有夏枯草治疗结膜炎的临床报道,但未见夏枯草治疗过敏性结膜炎的基础研究,且其机制不明。本研究采用OVA 诱导建立大鼠过敏性结膜炎模型,应用夏枯草干预结膜炎模型大鼠,研究结果表明夏枯草能有效减低过敏性结膜炎模型大鼠血清IL-1β 水平; 改善过敏性结膜炎大鼠角结膜的炎症,缓解角、结膜充血肿胀和嗜酸性粒细胞聚集; 抑制炎症小体NLRP3,Caspase-1 的活化和IL-1β 蛋白的表达和分泌,明显缓解大鼠眼睛的过敏症状,发挥良好的抗炎作用。其可能机制为过敏原诱导机体自身系统激活NLRP3,活化Caspase-1,进而介导其下游重要炎症因子IL-1β 分泌,引起过敏性结膜炎,而夏枯草能有效缓解这个病理进程,从而达到抗过敏性角结膜炎的作用。至于夏枯草清肝明目的功效关联及作用机制需进一步进行肝功能指标如转氨酶等进行研究,此外可研究夏枯草治疗其他眼科疾病包括眼表疾病和眼底疾病。
  • [资讯] 乌参醒脑方对缺血再灌注脑卒中大鼠的神经再生作用
    摘要:缺血性卒中是脑部血液循环障碍导致局部神经功能缺失疾病,高发病率、高致残、高治疗难度、预后差、危害性大。大多数在动物中风模型发现的有效神经保护剂在临床试验中都失败了,亟待研发有效防治中风后遗症的新药。促进缺血性中风大脑神经再生是目前治疗中风后遗症的一种有效的治疗手段。乌参醒脑方( Wushen-Xingnao Fang,WSXN)是在传统中医药理论指导下,在中成药人参首乌胶囊基础上,配伍活血化瘀中药银杏叶组成,其中WSXN 的活性成分为人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、二苯乙烯苷、银杏内酯B 等,各种成分含量分别为1. 96% 人参皂苷Rg1、2. 54% 人参皂苷Rb1、11. 11%二苯乙烯苷、1. 03% 银杏内酯B 等,具有良好的防治脑缺血损伤、血管性痴呆和帕金森病的效果。据报道乌参醒脑方中有效成分人参皂苷、二苯乙烯苷、银杏内酯在脑缺血中风方面有良好的神经保护作用,但其治疗缺血性中风机制尚未明确,本文探讨其对缺血性中风大脑神经再生作用及其机制。 材料与方法 1 药品与试剂 乌参醒脑方( 人参∶ 制何首乌∶ 银杏叶按1∶ 1∶ 1配伍,经60% 乙醇提取,大孔树脂吸附精制,再经60%乙醇冼脱、浓缩、真空干燥所得的标准提取物,其得率约50 g·kg-1,广东药科大学中医药研究院,批号: 20170928,用0. 5% 的CMC-Na 溶液混悬配制) ; 5’-BrdU( 美仑生物公司,批号: MB3126) ; 金纳多( 德国为威玛培博士药厂,研磨成粉备用,批号:9170416) 。实验分为假手术组、模型组、金纳多组( 80 mg·kg-1) ,乌参醒脑方组( 30,60 和120 mg·kg-1) 。所有药物用0. 5% CMC-Na 溶液配制所需浓度混悬液,4 ℃ 冰箱保存,用前37 ℃ 预热摇匀。当天按1 mL·100 g-1剂量灌胃( ig) 给药,假手术组与模型组给予等体积的0. 5% CMC-Na,连续给药14 d。 一抗BrdU ( Bu20a) Mouse mAb ( 美国CST 公司,批号: 5292) ; 一抗NeuN ( 英国Abcam 公司,批号: ab177487) ; Rabbit Anti-Bcl-2 antibody( 北京博奥森生物技术有限公司,批号: bs-4563R) ; Caspase-3( 8G10 ) Rabbit mAb,β-Actin ( 13E5 ) Rabbit mAb( 美国CST 公司,批号: 9665,4970) ; 二抗Alexa Fluor 488 标记山羊抗兔IgG( H + L) ,Alexa Fluor 594标记山羊抗小鼠IgG( H + L,上海翊圣生物科技有限公司,批号: 33106ES60,33212ES60) ; HRP-IgG 二抗( 武汉三鹰生物技术有限公司,批号: SA00001-2) ; 超氧化物歧化酶( SOD) 活性、谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-PX) 活性、丙二醛( MDA) 检测试剂盒( 碧云天生物技术研究所) 。 2 仪器 Eon 微孔板分光光度计( Bio Tek 公司) ; MithrasLB 940 微孔板式多功能分析仪( Berthold Technologies); Mini Champ Chemi 610 凝胶成像系统( 北京赛智创业) ; Perkin Elmer Vectra 3 多光谱荧光显微镜( 美国Perkinelmer 公司) 。 3 实验动物 雄性SPF 级SD 大鼠,共计80 只,鼠龄2 个月龄,体重250 ~ 280 g,广东省医学实验动物中心,质量合格证: 44007200037353,生产许可证号: SCXK( 粤) 2013-0002。动物饲养于广东药科大学实验动物中心SPF 级屏障环境。 4 MCAO 模型的建立 动物术前禁食12 h,体重250 ~ 280 g,称重后用7%水合氯醛( 400 mg·kg-1) 深度麻醉碘伏消毒后于颈部正中线偏右剪开皮肤,眼科镊沿肌肉层逐层分离肌肉。继续向下分离可见,分叉处继续向下分离可见。分离颈总动脉( common carotid artery,CCA)及其旁迷走神经,用缝合线结扎近心端CCA 和颈外动脉( external carotid artery,ECA) ,微型动脉夹夹闭颈内动脉( internal carotid artery,ICA) 段,注射针于CCA 近心端处刺一小口,从一小口插入线栓,使线栓从CCA 进入转至ICA,插线深度从线栓头部至CCA 遇阻力停止,缝合线绑紧线栓,缝合皮肤伤口,碘伏消毒。缺血1 h 后拔出线栓,实现再灌注。 5 动物分组和给药 根据行为学评分挑选20 分以下的SD 大鼠,随机分为模型组、金纳多组、WSXN 低、中、高剂量组,另设假手术组,每组10 只MCAO 手术后24 h 开始给药。WSXN 方标准提取物和金纳多片用0. 5%CMC-Na 制成对应浓度的混悬液,按金纳多( 80 mg·kg-1) 、WSXN 低剂量( 30 mg·kg-1) 、WSXN 中剂量( 60 mg·kg-1) 和WSXN 高剂量( 120 mg·kg-1) 剂量和1 mL /100 g ig 给药,qd,连续给药14 d,模型组和假手术组给予等量的溶剂。另外,各组动物于造模7 d 后开始腹腔注射( ip) BrdU( 50 mg·kg-1) 标记新增殖的神经细胞,qd,连续7 d。 6 神经行为学评分 各组动物给药期间,隔天记录动物体重和神经行为学评分( 24 分制) ,评分数值越低,神经功能缺损越严重。评分项目如下: a: 自主活动( 3 min 触碰笼壁次数) ,分为无自主活动,很少活动,活动触碰至少一侧笼子,活动触碰至少三侧笼子,分值分别为0,1,2,3分; b: 体型对称性,分为患侧无活动,患侧轻微活动,患侧活动但迟缓,体型对称,分值分别为0,1,2,3分; c: 前肢伸展,分为患侧无伸展,患侧轻微伸展,患侧伸展但不及正常侧,伸展对称,分值分别为0,1,2,3 分; d: 提尾试验( 患肢与垂线夹角) ,分为患侧前肢屈伸接近180°,患侧前肢屈伸接近90°,患侧前肢自然下垂,分值分别为0,1,2分; e: 身体倾倒,分为行走时倾倒严重,行走时身体轻微倾倒,行走时身体无倾倒,分值分别为0,1,2 分。 7 免疫荧光组织化学染色检测BrdU + /NeuN + 双标阳性细胞 各组给药14 d 后实验结束,用PBS 心脏灌注后分离脑组织。取部分脑组织,4%多聚甲醛固定组织24 h,20%,30%蔗糖脱水,冰冻切片7 μm 用PBS 洗涤切片3 次× 5 min,柠檬酸微波炉高温修复15 min,2 mol·L-1盐酸37 ℃ 变性30 min,5%山羊血清封闭45 min,小鼠抗BrdU 单克隆抗体( 1∶ 300) 和NeuN( 1∶ 3 000) 混合4 ℃孵育过夜。复温30 min,PBST洗涤3 次后,羊抗小鼠二抗FITC( 1∶ 300) 和羊抗兔Alexa 488( 1∶ 300) 孵育1 h,PBST 洗涤3 次后50%甘油封片于显微镜下观察。 8 脑组织中SOD,GSH-Px,MDA 含量的测定 取梗死侧脑组织,加入RIPA 裂解液匀浆后离心后取上清液。按照试剂盒说明书中的规定方法测定脑组织中SOD,GSH-Px,MDA 含量。 9 免疫印迹法检测梗死侧脑组织Bcl-2,Caspase-3蛋白表达水平 取脑组织上清液BCA 法进行蛋白定量,用裂解液将所有样品稀释至相同总蛋白浓度。加入Loadingbuffer 后95 ℃变性10 min,配胶上样后分别用80 和120 V 电压电泳。电泳后200 mA 恒流转膜90 min。将PVDF 膜取出用1 × TBST 洗涤3 次,每次5 min,室温摇床上用5%脱脂奶粉封闭1 h,TBST洗涤一抗4 ℃孵育过夜,TBST 洗涤后孵育HRP 二抗室温1 h,TBST 洗涤后于显影仪上显影。 10 数据处理 试验数据均以`x ± s 表示,用ANOVA 进行统计学检验,组间比较P < 0. 05 为差异有统计学意义。 结果 1 WSXN 方对MCAO 模型大鼠神经行为学功能的影响 MCAO 模型大鼠术后24 h 神经行为学功能评分显著降低( P < 0. 01) ,MCAO 大鼠出现身体偏瘫,肢体屈伸不利等症状。假手术组评分无变化。与假手术组相比,模型组大鼠神经学评分上升缓慢。与模型组相比,连续给药14 d 期间,各给药组大鼠神经行为学评分呈现逐渐上升,其中金纳多阳性组和WSXN 中、高剂量组改善最为明显( P < 0. 01) ,提示WSXN 方可以改善MCAO 动物的神经学功能缺陷,结果见图1。 2 WSXN 方对MCAO 模型动物神经元细胞增殖水平的影响 与假手术组相比,MCAO 模型大鼠缺血侧皮层区BrdU + /NeuN + 双标细胞数增加( P < 0. 01 ~0. 05) ,提示脑缺血应激能升高脑内神经细胞增殖水平。与模型组相比,各给药组大鼠缺血侧皮层区BrdU + /NeuN + 双标细胞数显著增加2. 1 ~ 4. 3 倍( P < 0. 01 ~ 0. 05) ,提示WSXN 方可以进一步升高脑内细胞增殖水平,促进梗死侧脑组织神经再生,结果见图2 和图3。 3 WSXN 方对MCAO 模型动物脑组织氧化应激水平的影响 与假手术组相比,模型组大鼠SOD 酶和GSHPx酶活力显著下降,MDA 含量则显著升高。表明MCAO 大鼠脑缺血再灌注损伤后,机体氧化应激水平升高。与模型组相比,连续给药14 d 治疗后各给药组氧化应激指标有不同程度的改善,其中金纳多阳性组和WSXN 中、高剂量组改善明显,提示WSXN 方可以清除自由基、提高MCAO 动物抗氧化应激损伤能力,减轻脑缺血再灌注的损伤,结果见图4。 4 WSXN 方对MCAO 模型动物凋亡蛋白水平的影响 与假手术组相比,模型组大鼠脑组织中Bcl-2蛋白表达显著下降1. 1 倍,Caspase-3 蛋白表达水平显著升高达2. 1 倍。与模型比相比,连续给药14 d后,各给药组抗凋亡蛋白Bcl-2 表达水平有不同程度的升高,促凋亡蛋白Caspase-3 表达水平则有不同程度的降低,以金纳多组和WSXN 高剂量组最为显著( P < 0. 05) 。提示WSXN 方可以通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2、下调促凋亡蛋白Caspase-3 的表达来调控神经细胞凋亡,结果见图5 和6。 讨论 缺血性脑卒中主要病因是颅内血管突然阻塞造成脑细胞急剧缺糖、缺氧从而导致缺血核心区的细胞在数分钟内死亡。影响缺血性脑损伤的关键因素有钙稳态失调、兴奋性毒性、过量自由基、线粒体功能破坏等。由于中枢神经系统疾病的复杂性和血脑屏障的存在,防治脑卒中药物的开发困难重重,亟待研发有效防治脑卒中的新药。 大脑中动脉梗塞( MCAO) 是模拟缺血性脑卒中的经典方法。我们在Longa 的MCAO 模型的基础上对造模方法进行优化。用体重250 ~ 280 g 大鼠,线栓直径0. 24 mm,插入深度为20 mm 左右这种条件下模型成功率高,稳定性好。 缺血性脑卒中主要导致2 个损伤区: 梗死核心区和半影区。在梗死核心,脑血流下降至能量衰竭阈值( 15% ~ 20%) 以下。该区域的细胞在最初几分钟内受到不可逆转的损伤,无法修复。半影区位于梗死核心和健康脑组织之间,半影区的细胞是可挽救的。目前FDA 唯一批准治疗缺血性脑卒中药物rtPA 由于其治疗窗狭窄( < 4. 5 h) 其应用受到了很大的限制。因此,研制出有效药物从根本上解决脑卒中后长期的神经功能障碍刻不容缓。本实验研究了乌参醒脑方对缺血性脑卒中大脑的神经再生作用。发现乌参醒脑方给药2 周可以显著改善MCAO 模型动物神经功能障碍,提高存活率和生存质量。并且乌参醒脑方可剂量依赖性促进脑缺血模型动物神经元的增殖,实现神经再生。 氧化应激损伤被认为是脑缺血发病机制密切相关的重要因素,缺血再灌注后导致大量的活性氧簇( ROS) 产生,诱发氧化应激损伤,从而导致神经功能障碍,细胞凋亡。乌参醒脑方可以提高MCAO 动物脑组织中抗氧化应激损伤能力,减轻脑组织的脂质过氧化产生,从而减轻脑缺血再灌注损伤。 神经细胞与脑微血管之间的联系复杂,神经干细胞的增殖、神经细胞新生受到各种调控因子的影响,新生神经细胞向缺血区迁移、分化才能完成神经结构功能重塑,实现神经再生。神经发生的过程包括增殖、分化、迁移和程序性细胞死亡( PCD)这几个层次,而PCD 分为凋亡、坏死和自噬性细胞死亡,PCD 可以调节最终集成到神经回路中的成熟神经元的数量。PCD 在调节成体神经发生和年轻神经元整合到成熟神经回路中也起着重要作用,凋亡是PCD 的重要一部分,其中Bcl-2 和Caspase-3 是调控凋亡通路的2 个关键蛋白,乌参醒脑方促进神经再生的作用与其能提高机体抗氧化应激能力,调控Bcl-2,Caspase-3 相关凋亡蛋白的表达密切相关。
  • [资讯] 骨龙胶囊联合抗风湿药治疗类风湿关节炎的临床观察
    摘要:类风湿关节炎( rheumatoid arthritis,RA) 是一种以关节病变为主的慢性、全身性、自身免疫性疾病,其病因复杂,症状多样,致残率高。在我国RA 的患病率约为0. 4%,在全世界约为0. 5% ~ 1. 0%。临床上以慢性、对称性、周围性多关节炎性病变为其主要特征,临床表现为受累关节疼痛、肿胀以及功能下降,本病以女性发病率高,男女比例约为1∶ 3。病理表现为关节滑膜的慢性炎症、血管翳形成,并出现关节的软骨和骨破坏,最终可导致关节畸形和功能丧失。RA 目前尚无根治的方法,治疗的目标为改善症状和体征,达到临床缓解或低疾病活动,延缓关节破坏,减少并发症,提高生活质量。目前临床上用于治疗RA 的药物包括非甾体抗炎药( non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs) 、改善病情的抗风湿药( DMARDs) 和糖皮质激素等,但缺乏选择性,长期高剂量使用易发生胃肠道反应、肝肾功能损害以及可能产生心血管事件,导致股骨头坏死、高血压、体重增加等。RA 病理过程复杂,多种因素可能在RA 疾病不同时期起作用,针对单一因素的治疗往往难以奏效。联用2 种以上作用机制、影响途径和毒性类型不同的药物,以增效减毒是当前公认的药物治疗策略。中医认为,RA 的基本病机为本虚标实,扶正祛邪为基本治法。祛邪同时应注意扶正,即祛邪不宜攻伐过猛,以免损伤正气; 且扶正不宜峻补,以防邪气壅滞。根据既往的研究结果,骨龙胶囊具有明确的抗炎镇痛作用,可阻断炎症反应,改善关节功能,延缓RA 的进程。甲氨蝶呤是RA 治疗的锚定药( anchor drug) ,但尚缺乏骨龙胶囊联合DMARDs 治疗RA 的高等级的循证医学证据。故本研究旨在观察骨龙胶囊联合DMARDs 治疗RA 的临床疗效及安全性,为疾病的治疗提供依据。 资料与方法 1 一般资料 本研究由中国中医科学院广安门医院牵头,并获得中国中医科学院广安门医院伦理委员会批准( 伦理委员会批件编号: 中国中医科学院广安门医院医学伦理委员会2011 第094 号) 。2012 年4月—2013 年9 月在中国中医科学院广安门医院、山东省中医院、安徽省中医院、山西省中医药研究院、北京中日友好医院、解放军总医院第七医学中心、北京大学第三医院等7 家医院同时开展。 纳入标准: ① 符合1987 年美国风湿病学会( American College of Rheumatology,ACR) 类风湿关节炎分类标准。② 符合中医痹症辨证属肝肾不足、瘀血痹阻证证型。③ 年龄18 ~ 65 岁。④ 如服用NSAIDs,则剂量至少已稳定4 周,如未服用,则至少已1 周未服。⑤ 如果使用甲氨蝶呤( methotrexate,MTX) ,则至少已经接受MTX 3 个月治疗,且剂量稳定在10 mg·周-1至少已4 周,且未合用其他DMARDs; 如果使用来氟米特,则至少已经接受来氟米特3 个月治疗,且剂量稳定在10 mg·d-1至少已4周,且未合用其他DMARDs。⑥ 如果口服糖皮质激素,则剂量( 相当于强的松的量) 必须≤15 mg·d-1至少已4 周。⑦ 获得患者知情同意。 排除标准: ① 不符合纳入标准者。② 4 周内使用过肌注或静注皮质激素。③ DAS28-3 评分> 5. 1分( 高活动性) 者。④ 重叠其他风湿病如系统性红斑狼疮、干燥综合征、严重的膝骨关节炎等者。⑤ 合并心血管、脑、肺、肝、肾和造血系统等严重疾病或近期有严重感染的患者。⑥ 妊娠期、哺乳期妇女及精神病患者。⑦ 白细胞低于3. 5 × 109·L-1、血小板低于90 × 109·L-1、血色素低于8. 5 g·dL-1的患者。⑧ 胃十二指肠溃疡、胃炎活动期或长期服用非甾体类药导致胃病者。⑨ 对试验药物过敏者。⑩ 1个月内参加过其他临床试验者。 本研究为分层区组随机、双盲、平行对照、多中心临床研究,受试病例数为240 例,分别按中心进行分层,借助SAS 统计软件PROC PLAN 过程语句,给定种子数,产生240 例受试者所接受处理( 试验药和对照药) 的随机安排,分为试验组120 例,其中骨龙胶囊联合甲氨蝶呤组40 例,骨龙胶囊联合来氟米特组80 例; 对照组120 例,其中骨龙胶囊模拟剂联合甲氨蝶呤组40 例,骨龙胶囊模拟剂联合来氟米特组80 例。 2 治疗方法 2. 1 试验药物 骨龙胶囊( 东阿阿胶股份有限公司,批号:111001) ,规格: 0. 5 g·粒-1 ; 甲氨蝶呤片( 上海信谊药业有限公司,批号: 110306) ,规格2. 5 mg·片-1;来氟米特片( 苏州长征-欣凯制药有限公司,批号:110408) ,规格10 mg·片-1; 骨龙胶囊模拟剂( 东阿阿胶股份有限公司提供,批号: 111001) ,规格: 0. 5g·粒-1; 所有试验用药均检验合格。 2. 2 服药方法 对照组: 骨龙胶囊模拟剂联合甲氨蝶呤组( 以下简写为单用甲氨蝶呤组) : 骨龙胶囊模拟剂,每次5 粒, tid,口服; 甲氨蝶呤片,10 mg·次-1,1次·周-1,口服; 骨龙胶囊模拟剂联合来氟米特组( 以下简写为单用来氟米特组) : 骨龙胶囊模拟剂,每次5 粒,tid,口服; 来氟米特片,10 mg·次-1,qd,口服。试验组: 骨龙胶囊联合甲氨蝶呤组: 骨龙胶囊,每次5 粒, tid,口服; 甲氨蝶呤片,10 mg·次-1,1次·周-1,口服; 骨龙胶囊联合来氟米特组: 骨龙胶囊,每次5 粒, tid,口服; 来氟米特片,10 mg·次-1,qd,口服。 2. 3 疗程 4 组疗程均设定为12 周。 2. 4 合并用药的规定 ① 试验期间,如入选时服用NSAIDs,则品种和剂量应维持不变,可根据情况减量,但不得加量。不得加用其他NSAIDs。② 试验期间,如入选时服用糖皮质激素,则品种和剂量应维持不变,禁止局部或静注、肌注糖皮质激素。③ 试验中,如关节疼痛剧烈且不能忍受,应及时和研究者联系,研究者可根据自己的判断,决定是否加用对症处理药物。允许加用的对症处理药物: 对乙酰氨基酚片,每次1 ~ 2 片( 0. 3 g·片-1) ,24 h 内不得超过7 片。研究者应在病历上记录合并用药服用时间、次数及剂量。但访视前1 d 不可服用。疗程结束时据此判断止痛药暴露程度。④ 试验期间,不得加用治疗本病/缓解本病症状的其他中医药物和治疗方法。⑤ 合并其他疾病必须继续服用的其他药物和治疗方法,必须在合并用药表中详细记录。 3 观察指标 患者基本情况: 年龄、性别、身高、体重、病史、病程、合并用药等信息。监测生命体征: 治疗前后测定体温、血压、呼吸、心电图等。实验室检查: 治疗前后血常规、尿常规、肝肾功能等。 4 疗效评价 4. 1 评价指标 达到ACR 评分标准改善程度≥20% ( ACR20)的患者比例、中医证候疗效、患者28 处关节疾病活动度积分( DAS28) 评分DAS28 ( 疾病活动性指数)和体征评分。 4. 2 评价标准 4. 2. 1 疾病疗效ACR20 ACR20: ① 触痛关节数减少≥20%。② 肿胀关节数减少≥20%。③ 以下5 条中3 条好转≥20%,a 患者对疼痛的评估; b 患者对疾病活动的整体评估; c 医生对疾病活动的整体评估; d 患者对活动能力的自我评估( 健康评估问卷HAQ) ; e 急性时相反应物( ESR 或CRP) 。 4. 2. 2 中医证候疗效 ① 症状缓解疗效按以下标准分级: 采用按中心分层的CMH 检验进行评价: 症状体征积分减少≥95% 为临床痊愈; 症状体征积分减少≥70% 为显效; 症状体征积分减少≥30% 为有效; 症状体征积分减少不足30%为无效。② 症状及体征评分的变化: 症状及体征评分为关节疼痛评分、关节压痛评分、关节肿胀评分、晨僵评分、关节屈伸不利评分之和,采用F 检验比较症状及体征评分总分的首次、4 周、8 周、末次、末次与首次访视的差值,列出平均数、标准差、中位数、最小值、最大值、F 统计量、确切P 值。 4. 2. 3 DAS28( 疾病活动性指数) 活动期判断标准采用国际上通常采用的DAS28, 28 个关节计分包括双肩、双肘、双腕、双手掌指关节、双手近端指间关节、双膝关节。DAS28-3 =[0. 56 × SQRT( 压痛数) +0. 28 × SQRT( 肿胀数) + 0. 70 × LN( 血沉) ]× 1. 08 +0. 16。缓解期DAS28 < 2. 6 分; 低活动性2. 6≤DAS28≤3. 2 分; 中等活动性3. 2 < DAS28≤5. 1 分;高活动性DAS28 > 5. 1 分。 5 安全性评价 采用单因素方差分析2 组受试者服药量、服药时间、研究时间; 采用χ2检验研究药物使用; 生命体征的比较组间采用单因素方差分析,组内采用配对t检验。记录不良事件的发生情况,包括种类、严重程度、发生频率及与研究药物的关系等。特别关注重度或严重不良事件。列出有临床意义实验室检查项目的异常值。 6 统计学方法 数据录入与管理由统计单位数据管理员负责,采用EPIdata 3. 0 软件编制数据录入程序,进行数据录入与管理。统计分析采用SAS 9. 2 软件。描述性统计分析用`x ± s 或列出均数、标准差、最大值、最小值、95%可信限等; 计量资料采用配对t 检验、单因素方差分析、协方差分析等方法; 计数资料采用χ2检验、Fisher 精确检验、CMHχ2检验; 等级资料采用秩和检验; 有效率的多中心分析计数资料采用CMHχ2法; 计量资料采用协方差分析。数据脱落及剔除标准:① 入组后发现受试者不符合纳入标准的病例。② 使用了方案规定的禁用药品,由于违背临床试验方案,需予剔除。③ 纳入后未曾用药的病例,需予剔除。④ 无服药后任何可评价记录的病例。 结果 1 病例入组、脱落及剔除情况 两组共入组240 例,试验组入组120 例,完成106 例,缺失3 例,脱落11 例; 对照组入组120 例,完成106 例,脱落14 例。全分析集( full analysis set,FAS) 和符合方案集( per protocol set,PPS) 相同,均为212 例,其中试验组106 例,对照组106 例。安全集( safety set,SS) 237 例,其中试验组117 例,对照组120 例。两组在年龄、病程、生命体征、本病病程、合并疾病、入选时合并用药等方面差异无统计学意义( P > 0. 05) ,具体见表1。 2 骨龙胶囊与甲氨蝶呤联合用药( 1-80 号) 2. 1 ACR20 治疗12 周后,ACR20 组间比较,骨龙胶囊联合甲氨蝶呤组的ACR20 高于单用甲氨蝶呤组,差异有统计学意义( P < 0. 05) ,详见表2。 2. 2 中医证候疗效 治疗4 周后,两组中医证候疗效组间比较,两组中医证候疗效的差异有统计学意义( P < 0. 05) 。治疗8 周、12 周后,两组中医证候疗效的差异无统计学意义,但骨龙胶囊联合甲氨蝶呤组疗效趋势优于单用甲氨蝶呤组。且试验组对于症状改善的起效时间快于对照组,详见表3。 2. 3 DAS28 比较 治疗12 周后,两组DAS28 与各组治疗前的评分相比均有明显下降,差异有显著统计学意义( P <0. 001) ,两组DAS28 评分均值和中位数( median,Md) 在治疗12 周后均有明显降低。治疗12 周后,两组DAS28 相对基线的变化值,骨龙胶囊联合甲氨蝶呤组的降低幅度- ( 1. 73 ± 0. 95) 大于单用甲氨蝶呤组- ( 1. 00 ± 0. 81) ,差异有统计学意义( P <0. 05) ,详见表4。 3 骨龙胶囊与来氟米特联合用药( 81-240 号) 3. 1 ACR20 治疗12 周后,ACR20 组间比较,骨龙胶囊联合来氟米特组的ACR20 高于单用来氟米特组,差异有统计学意义( P < 0. 05) ,详见表5。 3. 2 中医证候疗效 治疗治疗4 周、8 周后,两组中医证候疗效组间比较,差异无统计学意义,但骨龙胶囊联合来氟米特组疗效趋势优于单用来氟米特组。治疗12 周后,骨龙胶囊联合来氟米特组( 总有效率94. 29%) 优于单用来氟米特组( 总有效率76. 06%) ,差异有统计学意义( P < 0. 05) ,详见表6。 3. 3 DAS28 治疗12 周后,两组DAS28 评分与各组治疗前的评分相比同样均有明显下降,差异有显著统计学意义( P < 0. 001) ; 两组均值和中位数在治疗12 周后均有明显降低。骨龙胶囊联合来氟米特组的降低幅度- ( 1. 51 ±0. 89) 大于单用来氟米特组- ( 0. 71 ±0. 81) ,差异有显著统计学意义( P < 0. 001) ,详见表7。 4 安全性评价 骨龙胶囊联合DMARDs 组不良事件的发生率为2. 56%,骨龙胶囊模拟剂联合DMARDs 组的发生率为5. 00%,差异无统计学意义( P = 0. 499 6) 。骨龙胶囊联合DMARDs 组不良反应的发生率为2. 56%,骨龙胶囊模拟剂联合DMARDs 组的发生率为4. 17%,差异无统计学意义( P = 0. 722 0) 。骨龙胶囊联合DMARDs 组3 例不良反应分别表现为胃痛、胃部不适、口干; 骨龙胶囊模拟剂联合DMARDs组5 例不良反应分别表现为疗后转氨酶升高、白细胞下降。两组均未见与试验药物有关的实验室异常且有临床意义的严重不良事件。 讨论 RA 属中医“痹病”范畴。《证治准绳》记载: “痹病有风、有寒、有湿、有热,皆标也; 肾虚,其本也”。又《金匮要略·中风历节病脉证并治第五》曰“寸口脉沉而弱,沉即主骨,弱即主筋,沉即为肾,弱即为肝。汗出入水中,如水伤心。历节黄汗出,故曰历节”。“痹”者,闭也,含闭塞不通之意,患者经脉不通,邪留为瘀,“痹”与“瘀”有着密不可分的联系,从瘀论痹的理论由来已久,如《素问·举痛论》曰: “寒气入经而稽迟,泣而不行。客于脉外则血少,客于脉中则气不通”。清·王清任《医林改错》有“瘀血致痹说”,其曰“元气既虛,必不能达血管,血管无力,血必停留而瘀”,“寒气客于经脉,则血泣,血泣则不通”。《类证治裁·痹症》中论述痹病的病机为“良由营卫先虚,腠理不密,风寒湿乘虚内袭,正气为邪所阻,不能宣行,因而留滞,气血凝涩,久而成痹”。因此,痹病发病是内外合邪,而内外之间,又以正虚为本,这是痹病发病的关键。肝肾亏虚是痹病发生发展的内在原因,起决定性作用。同时,有痹必有瘀,风寒湿邪,瘀血痹阻是痹病的外在表现。 课题组依托十二五国家科技支撑计划进行的全国1 602 例中医证候分布特点规律研究,发现RA 肝肾不足证、痰瘀痹阻证的比例分别为13. 12% 和10. 16%,仅次于湿热阻络证、寒湿阻络证两大证候,同时复合证候分布中,各证候中兼有肝肾不足证候最为常见; 不同证型的RA 患者的病程差异比较,痰瘀痹阻证、肝肾不足证多见于长病程患者,与风湿痹阻证、寒湿痹阻证、湿热痹阻证、气血两虚证相比,差异具有统计学意义。谢丽萍等研究了广西地区RA 患者的证候与病程关系,肝肾阴虚病程最长。于秀明等对202 例RA 患者的证候分型调查结果表明,寒湿痹阻型、肾气虚寒型多见于疾病早期,瘀血痹阻主要见于疾病晚期。宋玉洁通过临床观察得出RA 早、中期中医证型以湿热阻络和寒湿阻络为主; 中晚期主要表现为痰瘀互结; 晚期以肝肾阴虚为主。何羿婷等研究认为RA 患者中肝肾不足兼痰瘀互结证病程较其他证型为长。说明RA若迁延不愈,复感外邪,内舍肝肾,造成肝肾不足; 或是湿热蕴结日久,耗伤阴精,损及肝肾,导致肝肾不足。临床上,长病程RA 患者容易出现腰膝酸软、畏寒肢冷等肝肾不足表现。痰浊瘀血既是RA 的病理产物,也是致病因素。痰浊瘀血壅滞经脉,深入骨髓,胶着不去,痰瘀互结,凝滞经脉而成顽痹。 针对RA“肝肾不足,瘀血痹阻”的病理病机特点,骨龙胶囊以狗腿骨为君药,补肾益气,通血脉、暖腰膝、填精髓; 辅以穿山龙为臣药,活血舒筋、祛风止痛。二者合用,一补一通,共散寒止痛、活血祛风、强壮筋骨之效。《本草纲目》曰狗腿骨“甘、平,无毒”,有补益作用。《中药大辞典》记载狗腿骨有健脾和络、活血生肌的作用,治风湿痛、腰腿无力、四肢麻木。基础研究发现狗骨胶有抗炎镇痛、促进骨折愈合的作用,其含有的氨基酸、微量元素、骨胶原等与天然虎骨接近,是虎骨的天然替代品。穿山龙为薯蓣科植物穿山龙的根茎,典籍记载穿山龙有活血舒筋、消食利水等作用,治风寒湿痹等病。基础研究证明,穿山龙薯蓣皂苷元具有诱导RA 滑膜细胞凋亡的作用。骨龙胶囊的作用机理研究表明,骨龙胶囊可以有效缓解RA 模型大鼠关节的肿胀程度,明显降低IL-1β,TNF-α 的含量,从而阻断炎症反应,改善关节功能,延缓RA 的进程,减轻RA 的破坏作用。 既往的研究表明,中药联合DMARDs 的疗效优于单用DMARDs。刘海采用骨龙胶囊联合甲氨蝶呤和柳氮磺吡啶治疗RA,入组60 例,随机分为对照组( 甲氨蝶呤和柳氮磺吡啶) 与试验组( 骨龙胶囊联合甲氨蝶呤和柳氮磺吡啶) ,疗程12 个月,试验组总有效率90%,对照组总有效率70%,试验组疼痛指数评分、晨僵时间、关节压痛指数、关节肿胀指数、关节功能指数改善均优于对照组。余文景等运用白芍总苷联合甲氨蝶呤和来氟米特治疗RA,共入组80 例,治疗4 周后,联合用药组总有效率为83. 33%,而单用甲氨蝶呤和来氟米特组总有效率为68. 42%,证明白芍总苷联合来氟米特治疗RA 疗效确切,不良反应小。李雪芬等采用益肾蠲痹丸联合MTX 治疗RA,也得到类似的结论。 本研究以骨龙胶囊与DMARDs( 甲氨蝶呤或来氟米特) 联用为试验组,骨龙胶囊模拟剂与DMARDs 联用为对照组,结果表明,骨龙胶囊联合DMARDs( 甲氨蝶呤或来氟米特) 治疗RA 的疗效优于对照组,主要体现在ACR20 及中医证候疗效上,且试验组对于症状改善的起效时间快于对照组。安全性评价两组比较不良事件及不良反应发生率均无统计学差异。试验组的不良反应表现为胃痛、胃部不适、口干,考虑与药物剂型为胶囊剂导致对胃部的刺激有关; 对照组不良反应表现为疗后转氨酶升高、白细胞下降,均为甲氨蝶呤或来氟米特预期的不良反应。 骨龙胶囊与DMARDs( 甲氨蝶呤或来氟米特)联用可显著改善患者的临床症状和体征,并且在研究中发现联合用药组的起效速度优于单用DMARDs,且无明显不良反应及毒副作用,表明骨龙胶囊联合DMARDS 是治疗RA 安全有效的方法,值得深入研究和推广应用。当然,本研究存在的问题一是周期较短,仅为12 周,此外,因研究力量有限,样本量较小,期待有更大样本量的研究验证。

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